馬齒莧多糖對反流性食管炎大鼠的作用及相關機制實驗研究

陳昶洲,李 莉,張 雯,凌江紅

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院消化科,上海 200021)

反流性食管炎指胃內容物和胃酸倒流進食管引起的食管炎癥反應,患者臨床多表現為反酸、燒心和胸痛等,病情嚴重者可出現食管出血和潰瘍的并發癥,并對患者的健康造成威脅[1]。調查[2]顯示,美國反流性食管炎發病率最高,約20%成年人合并反流性食管炎,歐洲發病率約10%。國內報道[3]顯示,反流性食管炎的發病率約5%～10%。反流性食管炎的治療主要分為減輕體重、體位調整和飲食習慣的非藥物治療及H2受體拮抗劑和質子泵抑制劑的藥物治療。既往治療方案雖可一定程度上減輕患者病情,但效果仍未達到預期。反流性食管炎的具體發病機制仍未被完全闡明,但炎癥反應被證實貫穿疾病發生、發展的全過程[4]。核因子(Nuclear factor,NF)-κB(NF-κB)/白細胞介素(Interleukin,IL)-6信號通路是參與激活機體炎癥反應的核心靶點,被證實在反流性食管炎炎癥的激活中扮演著尤為重要的角色[5]。馬齒莧多糖是馬齒莧的有效活性成分,具有抗菌抗炎、調節免疫和抗氧化等多種藥理活性[6]。然而,現階段馬齒莧多糖是否能通過調節食管炎癥促進反流性食管炎病情轉歸鮮有報道,尤其是其作用機制亟待明確。基于此背景,本研究擬通過構建反流性食管炎大鼠模型,以期闡明馬齒莧多糖對大鼠食管炎癥的治療價值并深入闡明其作用機制,旨在為后續臨床綜合治療方案的構建提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40只體重220 g左右的SD大鼠為研究對象。所有大鼠購置后均在我中心實驗室進行1周的適應性喂養。

1.2 主要試劑 馬齒莧藥材購自上海源葉生物科技有限公司;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海初態生物科技有限公司;TRIzol購自上海尚寶生物科技有限公司;SYBRR Green熒光染料試劑盒購自上?；菡\生物科技有限公司。

1.3 馬齒莧多糖制備 取干燥馬齒莧藥材600 g,采用清水進行清洗,文火進行水煎。取3次過濾藥液濃縮至600 ml,并采用無水乙醇將藥液濃度調整至75%,靜置24 h后進行洗滌處理,最終得到白色多糖粉末。待需要使用時制備成對應濃度。

1.4 大鼠分組與處理 將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、馬齒莧多糖低劑量組、馬齒莧多糖中劑量組和馬齒莧多糖高劑量組,每組8只。除對照組外,其他組構建模型。馬齒莧多糖低、中、高劑量組分別給予7.5、15、30 g/kg馬齒莧多糖灌胃,對照組和模型組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃,連續10 d。

1.5 反流性食管炎大鼠模型制備 所有需要進行模型制備的大鼠均采用夾尾刺激法+導尿管球囊擴張法建立反流性食管炎動物模型。采用止血鉗夾住大鼠尾巴將大鼠激怒,每次40 min,并間隔20 min更換夾尾的地方,所有大鼠均連續刺激7 d,每天進行刺激1次。最后1 d夾尾刺激完成后對大鼠腹腔注射10%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉后逐層分離大鼠腹腔皮膚及肌肉組織,暴露并游離食管下段及賁門處,暴露食管后將兩條完全消毒的橡皮筋放置在食管后方,向導尿管氣囊內注入5 ml氣體后將氣囊向外拉,拉出操作在感受到阻礙且無法再拉出時停止。隨后將氣囊內的氣體吸出,并將氣囊向食管內拉,使氣囊位置處于食管下括約肌(LES)處。再次進行氣體注射,待LES充分擴張后將事先放置的橡皮筋牽拉以固定球囊并維持5 min,最終使食管下括約肌松弛,則視為建模成功。

1.6 ELISA法檢測相關炎癥因子和胃腸激素表達水平 取大鼠食管組織并采集血樣,3500 r/min條件下低速離心10 min,靜置20 min后分離上清,并置入-80 ℃冰箱待測。采用ELISA法檢測炎癥因子[腫瘤壞因子(TNF)-α、IL-1β和IL-8]及胃腸激素[血管活性腸肽(VIP)、胃腸饑餓激素(Ghrelin)、胃泌素(GAS)]表達水平。

1.7 Western blot檢測NF-κB/IL-6信號通路蛋白表達水平 取食管組織進行研磨、勻漿以提取組織中總蛋白,并采用BCA法檢測相應蛋白濃度。向樣品中加入緩沖液并對其進行加熱,待加熱至沸騰后制作凝膠。隨后采用電轉移法將蛋白轉移至PVDF,并陸續加入一抗和二抗進行孵育。孵育完成后采用Bio-Rad Quantity 4.5.2軟件測定吸光度(A)并計算NF-κB和IL-6蛋白相對表達水平。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關基因表達水平 取大鼠食管組織,采用TRIzol法提取總RNA,并采用SYBRR Green熒光染料試劑盒和ABI Step One PCR儀進行反轉錄操作。反轉錄條件:98 ℃、50 ℃和37 ℃條件下進行反轉錄操作,待反轉錄為cDNA后進行qRT-PCR擴增,并以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。反應條件:65 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,95 ℃ 10 min,共40個循環。最后參考2-ΔΔCt計算原癌基因c-myb、增殖細胞核抗原(PCNA)和Ki-67 mRNA相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠炎癥因子水平比較 見表1。與對照組比較,模型組和馬齒莧多糖不同劑量組TNF-α、IL-8、IL-1β表達水平明顯更高,且馬齒莧多糖高劑量組顯著低于模型組、馬齒莧多糖低劑量組和中劑量組(均P<0.05)。

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較(μg/L)

2.2 各組大鼠NF-κB、IL-6蛋白相對表達水平比較 見表2。與對照組比較,模型組和馬齒莧多糖不同劑量組NF-κB、IL-6蛋白表達水平明顯更高,且馬齒莧多糖高劑量組顯著低于模型組、馬齒莧多糖低劑量組和中劑量組(均P<0.05)。

表2 各組大鼠NF-κB、IL-6蛋白相對表達水平比較

2.3 各組大鼠VIP、Ghrelin、GAS表達水平比較 見表3。與對照組比較,模型組和馬齒莧多糖不同劑量組Ghrelin、GAS表達水平明顯更低,VIP明顯更高;馬齒莧多糖高劑量組Ghrelin、GAS表達水平顯著高于模型組、馬齒莧多糖低劑量組和中劑量組,VIP顯著低于模型組、馬齒莧多糖低劑量組和中劑量組(均P<0.05)。

表3 各組大鼠VIP、Ghrelin、GAS表達水平比較(μg/L)

2.4 各組大鼠c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA相對表達水平比較 見表4。與對照組比較,模型組和馬齒莧多糖不同劑量組c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA表達水平明顯更高,且馬齒莧多糖高劑量組顯著低于模型組、馬齒莧多糖低劑量組和中劑量組(均P<0.05)。

表4 各組大鼠c-myb、PCNA、Ki-67 mRNA相對表達水平比較

3 討 論

飲食結構的轉變致使反流性食管炎的發病率逐年升高,胃酸和膽汁經食管向呼吸道和口腔中反流時可對沿途的呼吸道和口腔造成損傷[7]。為進一步提高臨床治療反流性食管炎的臨床效果,進一步明確疾病的發生機制并尋找干預靶點尤為重要。本研究參考王強等[8]的方法制備了反流性食管炎大鼠模型,結果發現,模型組大鼠食管炎癥被顯著激活,且VIP、Ghrelin和GAS參與胃腸興奮的激素存在嚴重的表達紊亂,提示靶向調節反流性食管炎大鼠的胃排空和抑制炎癥是治療的潛在靶點。

抑制炎癥反應水平一直是反流性食管炎患者治療的重要靶點。TNF-α是重要的促炎因子,其表達上調后可加重食管黏膜損傷,從而使反流性食管炎患者病情發生惡性進展[9]。IL-8是機體中重要的趨化因子,高表達的IL-8可促使炎癥細胞向病灶部位集聚,從而導致病灶處形成炎癥級聯反應并加重病情進展。有研究[10]證實,IL-8在食管炎患者表達上調且與炎癥反應的過度激活密切相關。IL-1β是重要的炎癥介質,被證實在反流性食管炎中表達上調。研究[11]發現,胃酸反流后可對食管造成損失并激活炎癥,在炎癥反應激活的過程中IL-1β的表達被激活,高表達的IL-1β可繼發引起食管平滑肌收縮并導致病情加重,同時還可促進炎癥細胞的活化和浸潤進一步導致食管處炎癥反應升高,從而使病情進一步加重。本研究結果顯示,反流性食管炎大鼠采用馬齒莧多糖進行干預可有效抑制TNF-α、IL-8、IL-1β的表達,且采用大劑量進行干預可有效提高對炎癥因子的抑制作用,表明馬齒莧多糖可有效抑制反流性食管炎大鼠食管部位的炎癥反應。Rahimi等[12]研究證實,馬齒莧的有效成分具有抗炎效果。Noorbakhshnia等[13]研究表明,馬齒莧可通過靶向抑制TNF-α的表達減輕炎癥反應。

NF-κB/IL-6信號通路是調控機體炎癥因子表達的重要信號通路。NF-κB是一種轉錄因子,可調控炎癥相關因子的表達,其中IL-6是其重要的下游因子,亦是促進機體炎癥反應的關鍵信號因子。本研究結果顯示,反流性食管炎大鼠食管組織NF-κB、IL-6的蛋白表達水平明顯升高,采用馬齒莧多糖治療后NF-κB/IL-6信號通路相關蛋白的表達明顯被抑制,且大劑量治療對其抑制作用更加顯著。這預示著馬齒莧多糖靶向調節食管組織的炎癥水平可能與抑制NF-κB/IL-6信號通路的激活有關。Miao等[14]研究證實,馬齒莧可通過抑制NF-κB相關的炎癥信號表達發揮抗炎作用。Jia等[15]研究證實,馬齒莧多糖可通過靶向調節Toll樣受體(TLR)4/髓分化因子88(MyD88)/NF-κB信號通路抑制下游炎癥因子的表達。

VIP是一種神經肽,主要分布在腸道和胃,參與調控胃腸道的收縮,從而促進胃排空[16]。Ghrelin是一種胃腸道激素,主要參與能量代謝和胃排空的調節。GAS是一種胃腸道激素可通過激活其受體的表達從而抑制胃酸分泌和促進胃排空[17]。本研究結果顯示,馬齒莧多糖有助于調節VIP、Ghrelin、GAS的表達,從而增加大鼠的胃排空,這表明馬齒莧多糖不僅有利于反流性食管炎大鼠食管炎癥的抑制,還有利于促進胃排空,從而從疾病發生的機制上緩解病情。

反流性食管癌和食管腺癌是一個連續發展的過程,起初的食管炎癥可因上皮損傷和黏膜破壞并進行性發展而出現不典型增生并最終演變為腺癌。c-myb是一類原癌基因主要定位在消化道上皮和神經系統中,可參與調節多種促增殖基因和抗凋亡基因的調控,從而促進多種惡性腫瘤的發生與發展[18]。PCNA和Ki-67是目前已知受c-myb調節的促增殖基因,可作為客觀反映細胞增殖能力的標志分子[19]。本研究結果顯示,馬齒莧多糖可有效抑制c-myb、PCNA和Ki-67的表達,提示馬齒莧多糖還可抑制食管上皮過度增生,從而降低癌變風險。Zhao等[20]研究表明,馬齒莧多糖可通過影響細胞周期、調節細胞凋亡等機制發揮抗腫瘤活性。然而,馬齒莧多糖是否有助于進一步應用于食管腺癌的預防仍需進一步實驗論證。

綜上所述,反流性食管炎大鼠采用馬齒莧多糖進行干預可有效抑制食管組織炎癥,其機制與抑制NF-κB/IL-6信號通路有關。此外,馬齒莧多糖可調節胃腸激素表達以促進胃排空,同時還可抑制促增殖基因表達而降低食管惡性病變的發生風險。