長(zhǎng)鏈非編碼RNA SIL對(duì)肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smads通路的影響

魏士剛,馬雪梅,宿海峰

(1.北京航天總醫(yī)院,北京 100076;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)

肺炎是常見的肺部疾病,對(duì)老人及小兒的致死率較高,且該病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率及病死率均較高[1-2]。該病主要由肺炎鏈球菌感染所引起,使肺上皮細(xì)胞凋亡增加并產(chǎn)生炎性損傷。肺上皮細(xì)胞具有修復(fù)肺組織的作用,該細(xì)胞的損傷與肺炎的病程進(jìn)展聯(lián)系密切[3]。炎性因子的異常釋放也是肺炎產(chǎn)生及發(fā)展的重要原因。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)可聚集炎性細(xì)胞,使腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素細(xì)胞-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6等炎癥因子釋放增加。TGF-β1發(fā)揮作用主要依靠TGF-β1/Smads通路來(lái)完成。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)該通路參與多種肺部疾病的發(fā)生與發(fā)展,通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)加重病情,但其在肺炎鏈球菌引起的肺炎中的具體作用機(jī)制尚不明確。目前,細(xì)菌性肺炎仍是嬰兒和老年人致命的肺病[4],因此探究肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及炎性損傷對(duì)于肺炎的治療至關(guān)重要。大量研究證明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)與肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞損傷有關(guān),如lncRNA SOX2OT、lncRNA PVT1、lncRNA H19、lncRNA TUG1等均參與了肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞損傷過(guò)程。目前證實(shí),突觸極蛋白2(Synaptopodin 2,SYNPO2)第4個(gè)內(nèi)含子lncRNA SIL是肺纖維化的抑制因子,沉默lncRNA SIL可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的增殖及遷移。但lncRNA SIL對(duì)肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響以及具體作用機(jī)制鮮有報(bào)道。基于此,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞,研究lncRNA SIL對(duì)該細(xì)胞增殖、凋亡及TGF-β1/Smads通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肺泡上皮細(xì)胞株A549、HEPApiC、肺泡Ⅱ型細(xì)胞(AECⅡ)購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 PCR引物序列(貨號(hào):C10000,廣州市銳博生物科技有限公司);CCK-8溶液(貨號(hào):C0005,Target Mol中國(guó));TGF-β1一抗(貨號(hào):BJ-YK1002,上海邦景實(shí)業(yè)有限公司);Smad 2一抗(貨號(hào):FK-CV0718R,上海延慕實(shí)業(yè)有限公司);Smad 3一抗(貨號(hào):PL0401072,深圳市豪地華拓生物科技有限公司);Smad 6一抗(貨號(hào):jlcR23329,江西江藍(lán)純生物試劑有限公司);Smad 7一抗(貨號(hào):orb97080,武漢博歐特生物科技有限公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(貨號(hào):127-035-099,上海研卉生物科技有限公司);TNF-α、IL-1β和 IL-6檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SP24046、SP29541、SP27023,武漢賽培生物科技有限公司)。酶標(biāo)儀(型號(hào):Multiskan FC,北京海天友誠(chéng)科技有限公司);流式細(xì)胞儀(型號(hào):Agilent Novo Cyte Quanteon,中國(guó)安捷倫科技有限公司);PCR儀(型號(hào):GET3XG,杭州柏恒科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):在含1×105U/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素以及5 μmol/L 紫杉醇的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)HEPApiC、A549、AECⅡ細(xì)胞,待培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí),采用胰酶消化,離心、重懸、傳代,取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEPApiC、A549、AECⅡ細(xì)胞接種于6孔板中,密度為1×105個(gè)/孔,待細(xì)胞生長(zhǎng)至3/4時(shí),加入1×108個(gè)/ml的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染,檢測(cè)lncRNA SIL在HEPApiC、A549、AECⅡ細(xì)胞以及被R6感染的細(xì)胞中的表達(dá)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:于6孔板中接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),將A549細(xì)胞分為四組。A549組:A549細(xì)胞不做任何處理。A549+R6組:待A549細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí),加入1×108個(gè)/ml的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染。lncRNA SIL mimic組:待細(xì)胞融合至50%～60%時(shí),用LipofectamineTM3000試劑將lncRNA SIL模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h后加入1×108個(gè)/ml的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染。lncRNA SIL siRNA組:待細(xì)胞融合至50%～60%時(shí),用LipofectamineTM3000試劑將lncRNA SIL抑制物(siRNA)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h后加入1×108個(gè)/ml的R6進(jìn)行感染。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)lncRNA SIL表達(dá):取A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞, R6感染的A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞,采用TRIzol法提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。lncRNA SIL正向引物序列為5’-GAATCTGGCTGGCTGGAATTATACATGTCT-3’,反向引物序列為5’ -CATTGCCTTGGGTTCTTATTGGTGGGATG-A-3’。 GAPDH正向引物序列為5’-ATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTAT-3’,反向引物序列為5’-TACTGACTCGCTCTTCACAGGCCTAC-3’。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況:將A549細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種到96孔板中,放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入CCK-8溶液(10 μl),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況:將A549細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種到96孔板中培養(yǎng)48 h,采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,3000 r/min離心5 min,離心半徑12 cm,取上清。PBS清洗后加入100 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,并向其中依次加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,混勻后無(wú)光反應(yīng)15 min,加入1×Binding Buffer 400 μl后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 免疫印跡檢測(cè)TGF-β1/Smads通路蛋白表達(dá):取各組A549細(xì)胞,胰酶消化后提取蛋白,BCA測(cè)定蛋白濃度,將蛋白溶液與緩沖液混勻(4∶1),煮沸后變性后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入TGF-β1、Smad 2、Smad 3、Smad 6、Smad 7一抗(1∶1000)孵育4 h。加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記二抗(1∶2000),封閉1 h。取出PVDF膜,清洗,DAB顯色后照相,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。在本實(shí)驗(yàn)中,另設(shè)抑制劑組(TGF-β1/Smad抑制劑SIS3):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,待生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí),加入1×108個(gè)/ml的肺炎鏈球菌R6進(jìn)行感染,將0.5 ml提前配置好的含10 ng/ml SIS3的DMEM培養(yǎng)基放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),于24 h后收取細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組炎癥因子表達(dá):將A549細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種到96孔板培養(yǎng)48 h,采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,3000 r/min離心5 min,離心半徑12 cm,取上清。檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA SIL在A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞以及R6感染的A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞中的表達(dá) 見圖1。lncRNA SIL在A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞中的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。lncRNA SIL在A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞中的表達(dá)低于在R6感染的A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞中的表達(dá)(均P<0.05)。在R6感染的A549、HEPApiC、AECⅡ細(xì)胞中,lncRNA SIL在A549細(xì)胞中的表達(dá)最高(P<0.05),因此本研究后續(xù)運(yùn)用A549細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

注：與A549比較,*P<0.05;與HERApiC比較,#P<0.05;與AECⅡ比較,△P<0.05;與A549+R6比較,▲P<0.05

2.2 各組細(xì)胞lncRNA SIL表達(dá)比較 見圖2。與A549組比較,A549+R6組lncRNA SIL表達(dá)升高(P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL mimic組lncRNA SIL表達(dá)升高,lncRNA SIL siRNA組表達(dá)降低(均P<0.05)。與lncRNA SIL mimic組比較,lncRNA SIL siRNA組lncRNA SIL表達(dá)降低(P<0.05)。

注:與A549組比較,*P<0.05;與A549+R6組比較,#P<0.05;與lncRNA SIL mimic組比較,△P<0.05

2.3 各組細(xì)胞增殖率比較 見表1。與A549組比較,A549+R6組不同時(shí)間細(xì)胞增殖率降低(均P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL mimic組不同時(shí)間細(xì)胞增殖率降低,lncRNA SIL siRNA組不同時(shí)間細(xì)胞增殖率升高(均P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞增殖率比較(%)

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 見圖3。A549組、A549+R6組、lncRNA SIL mimic組和lncRNA SIL siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(1.97±0.52)%、(32.33±4.15)%、(45.63±4.72)%和(10.25±2.13)%。與A549組比較,A549+R6組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL mimic組細(xì)胞凋亡率增加,lncRNA SIL siRNA組細(xì)胞凋亡率降低(均P<0.05)。

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況

2.5 各組細(xì)胞TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表2。與A549組比較,A549+R6組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)升高,Smad 6、Smad 7蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL mimic組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)升高,Smad 6、Smad 7蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL siRNA組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)降低,Smad 6、Smad 7蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。lncRNA SIL siRNA組與抑制劑組各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組細(xì)胞TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.6 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較 見表3。與A549組比較,A549+R6組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(均P<0.05)。與A549+R6組比較,lncRNA SIL mimic組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,lncRNA SIL siRNA組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(均P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較(μg/L)

3 討 論

肺炎鏈球菌是革蘭陽(yáng)性菌的一種,感染肺上皮細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致其凋亡并產(chǎn)生炎性損傷,進(jìn)而引發(fā)肺炎。根據(jù)相關(guān)報(bào)道,每年由于肺炎而死亡的人數(shù)近200萬(wàn)人,已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。因肺炎鏈球菌所引起的肺炎占重癥肺炎的50%以上,因此抑制肺炎鏈球菌所感染的肺上皮細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖對(duì)肺炎的治療至關(guān)重要。肺上皮細(xì)胞凋亡對(duì)肺炎的產(chǎn)生及發(fā)展具有重要作用。研究[5-6]顯示,肺炎鏈球菌通過(guò)促進(jìn)肺上皮細(xì)胞凋亡加重疾病。

lncRNA具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用,肺炎患者體內(nèi)的lncRNA表達(dá)異常。例如,lncRNA漿細(xì)胞瘤異位基因1(PVT1)在肺炎鏈球菌導(dǎo)致的肺炎中異常高表達(dá),抑制其表達(dá)后可抑制A549細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)[7]。徐義松等[8]研究顯示,lncRNA性別決定相關(guān)基因2重疊轉(zhuǎn)錄本(SOX2OT)在肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞中高表達(dá),抑制其表達(dá)后可抑制肺泡細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)。lncRNA SIL是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。研究[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA SIL異常高表達(dá),其可控制A549細(xì)胞的增殖及遷移能力。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是肺泡上皮細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)鍵,是肺纖維化發(fā)生的重要機(jī)制。有研究[10]將沉默的lncRNA SIL轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,結(jié)果顯示低表達(dá)的lncRNA SIL可通過(guò)抑制肺泡上皮細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化來(lái)抑制肺纖維化。這提示沉默lncRNA SIL后能夠促進(jìn)肺泡上皮A549細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌可抑制肺上皮A549細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡,在感染肺炎鏈球菌的肺上皮A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SIL高表達(dá),抑制其表達(dá)后A549細(xì)胞增殖增加,凋亡減少。上述結(jié)果提示沉默lncRNA SIL可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖并抑制A549細(xì)胞凋亡。

炎癥反應(yīng)激活是肺炎產(chǎn)生及發(fā)展的重要原因之一。TNF-α的異常高表達(dá)會(huì)加重炎性反應(yīng),并導(dǎo)致機(jī)體炎性損傷加重[11]。IL-1β可增加炎癥因子的釋放。IL-6可直接參與炎癥反應(yīng)[12]。在肺炎鏈球菌感染的肺上皮細(xì)胞中,TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)顯著升高[13-15]。TGF-β1具有聚集炎癥細(xì)胞,促進(jìn)上述炎性因子釋放的作用[16]。TGF-β1主要由配體、受體、Smads蛋白等構(gòu)成,首先配體與Ⅱ型受體結(jié)合,募集并磷酸化Ⅰ型受體,后與Smads 相關(guān)蛋白結(jié)合,參與基因調(diào)控[17]。TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由Smads家族介導(dǎo)。TGF-β1主要通過(guò)TGF-β1/Smads通路發(fā)揮調(diào)控生物學(xué)效應(yīng)的作用,主要為Smad 2、Smad 3、Smad 6和Smad 7[18-19]。肺炎鏈球菌感染肺上皮細(xì)胞后炎性細(xì)胞合成并釋放TGF-β1,TGF-β1/Smads信號(hào)通路被激活,釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥介質(zhì)[20]。在本實(shí)驗(yàn)中,肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細(xì)胞后,TGF-β1/Smads通路被激活,促進(jìn)炎癥因子水平增加,在沉默lncRNA SIL后TGF-β1、Smad 2、Smad 3降低,Smad 6、Smad 7升高,表明該通路被抑制,使得炎癥因子水平降低。本實(shí)驗(yàn)另設(shè)立了TGF-β1/Smads通路的抑制劑組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA SIL后與該通路抑制劑的作用接近,提示lncRNA SIL可抑制TGF-β1/Smads通路的激活。

綜上所述,肺炎鏈球菌感染后,沉默lncRNA SIL可逆轉(zhuǎn)肺上皮細(xì)胞凋亡增加及增殖減少的情況,并抑制TGF-β1/Smads通路激活,減少炎癥因子釋放,抑制炎性反應(yīng)。