基于細(xì)胞焦亡途徑探討高良姜素對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)機(jī)制

王浩坤 劉成霞濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化病研究所，濱州 56600；濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，濱州 56600

潰瘍性結(jié)腸炎是一種腸道非特異性炎癥性疾病，具有慢性復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)［1］。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，以西方發(fā)達(dá)地區(qū)最高，但亞洲和西班牙裔人口的發(fā)病率近年來(lái)有所增加［2］。目前，治療藥物雖然可以使疾病得到長(zhǎng)期緩解，但停藥后易復(fù)發(fā)。因此，研究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、積極探索潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療至關(guān)重要。

細(xì)胞焦亡是一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）介導(dǎo)的程序性的細(xì)胞死亡。多種損傷因子被核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain like receptors，NLRs）識(shí)別，進(jìn)一步形成炎性小體，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡［3］。通過(guò)在質(zhì)膜上形成孔，引起大量促炎因子釋放，如白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18等，引發(fā)炎性反應(yīng)［4］。研究表明，敲除NLRP3 基因的實(shí)驗(yàn)小鼠，經(jīng)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)后，其結(jié)腸炎的癥狀相對(duì)較輕，應(yīng)用藥物阻斷Caspase-1 與敲除NLRP3 基因均可減輕DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，且效果相似［5-6］。

高良姜素（galangin）是一種從蜂膠以及高良姜中提取的天然黃酮類(lèi)化合物。此外，高良姜素能明顯改善DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織病理改變和組織損傷，下調(diào)Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)，抑制核因子（NF）-κB p65 的活化，降低IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α炎癥細(xì)胞因子水平，并且具有抗氧化作用［7］?？梢?jiàn)，高良姜素可以通過(guò)抗炎、抗氧化等來(lái)減輕潰瘍性結(jié)腸炎，但在細(xì)胞焦亡方面并無(wú)研究，所以其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。我們通過(guò)建立DSS 誘導(dǎo)小鼠的結(jié)腸炎模型，通過(guò)高良姜素進(jìn)行干預(yù)，驗(yàn)證了高良姜素與細(xì)胞焦亡的關(guān)系，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了新的思路。

材料與方法

1.動(dòng)物材料與試劑

C57BL/6 雄性小鼠，6～8 周齡，（23±2.0）g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；DSS，Coolaber 公司；高良姜素，美國(guó)MCE 公司；美沙拉嗪（艾迪莎），上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司；4%多聚甲醛；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，大連美侖生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠IL-18 ELISA 試劑盒，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；小鼠/兔免疫球蛋白G（IgG）-免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；NLRP3 抗體，武漢博士德生物工程有限公司；Caspase-1 抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2.儀器設(shè)備

離心機(jī)，德國(guó)eppendorf 公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Leica 公司；石蠟包埋機(jī)，Leica 公司；病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)BioTek儀器有限公司；恒溫孵育箱，Thermo Fisher Scientific 公司；蓄電顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

3.方法

3.1.實(shí)驗(yàn)分組 C57BL/6 雄性小鼠30 只，均為SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠，經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，決議編號(hào)：20210808-20。每組6 只，分別為正常對(duì)照組、模型組、高良姜素組（40 mg·kg-1·d-1）、美沙拉嗪組（0.5 g·kg-1·d-1）、高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組（高良姜素40 mg·kg-1·d-1、美沙拉嗪0.5 g·kg-1·d-1），均按0.1 ml/10 g 灌胃給藥。正常對(duì)照組小鼠自由飲用蒸餾水，無(wú)藥物干預(yù)。除對(duì)照組外，其余每組小鼠從造模第1 天開(kāi)始自由飲用3.5% DSS 溶液，同時(shí)給予藥物灌胃，每天1次，共7 d。造模期間每組小鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，定期給予更換墊料，并每天觀察造模效果，同時(shí)根據(jù)McCarthy 等［8］制定的疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病炎癥程度評(píng)估。7 d后處死小鼠，留取血液4 ℃離心（2000×g15 min）后收集血清，放于-80 ℃冰箱保存，同時(shí)游離結(jié)腸組織，部分置于4%多聚甲醛中固定備用。

3.2.HE 染色及組織損傷指數(shù)（histological index，HI）評(píng)分 將固定好的結(jié)腸組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度為4 μm）、脫蠟、HE染色、封片等處理。根據(jù)Dieleman等［9］制定的HI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

3.3.免疫組化法 經(jīng)制備好的石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、滴加一抗（均以1：200稀釋?zhuān)⒌渭由窖蚩雇迷噭⒍被?lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素復(fù)染、脫水和透明等處理。在40×光鏡下，相同觀察條件下每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野，棕黃色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。使用Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行分析，利用OD=IOD/Area表示陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況。

3.4.ELISA 檢測(cè)小鼠血清中的IL-1β、IL-18的含量 使用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中的IL-1β、IL-18的含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和二次回歸方程，帶入待測(cè)樣本OD 值，得出待測(cè)樣本濃度。

4.統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個(gè)樣本間比較采用One-way ANOVA 進(jìn)行組間分析。采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪制圖表。采用Image-Pro Plus 6.0 對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析處理。P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.造模情況及DAI評(píng)分

正常對(duì)照組小鼠一般情況良好，體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)。模型組從DDS 干預(yù)第3～4 天，小鼠活躍度較前降低，出現(xiàn)軟便、稀便，體質(zhì)量開(kāi)始下降，第5～7 天小鼠活動(dòng)減少，出現(xiàn)肉眼血便，體質(zhì)量明顯下降。高良姜素組、美沙拉嗪組、高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組小鼠從DSS 干預(yù)第4 天起出現(xiàn)活動(dòng)度減低、體質(zhì)量下降、稀便、血便、飲食減少，但上述癥狀較模型組輕。各組DAI評(píng)分見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠DAI評(píng)分比較

2.各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及大體觀

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸無(wú)明顯縮短（71.33±2.94）mm，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短（45.71±5.08）mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；其余各治療組小鼠結(jié)腸均有不同程度縮短，程度較模型組輕，并且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸腸壁無(wú)水腫，黏膜無(wú)出血、潰瘍等表現(xiàn)；模型組小鼠結(jié)腸腸壁水腫，腸黏膜有出血、潰瘍等表現(xiàn)；其余各治療組上述表現(xiàn)較模型組輕。具體如圖2、3。

圖2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度對(duì)比

3.各組小鼠結(jié)腸組織HE染色及HI評(píng)分

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，腺體結(jié)構(gòu)完好排列整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)DSS 干預(yù)后，結(jié)腸黏膜組損傷嚴(yán)重，腺體結(jié)構(gòu)異常，隱窩破壞，可見(jiàn)糜爛、潰瘍形成，黏膜及黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)高良姜素、美沙拉嗪處理后，結(jié)腸黏膜損傷程度有不同程度減輕，各組HE染色見(jiàn)圖3，HI評(píng)分見(jiàn)圖4。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織蘇木精-伊紅（HE）染色（×100）

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織HI評(píng)分

4. 免疫組化法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、Caspase-1的表達(dá)

如圖5、6所示，NLRP3、Caspase-1表達(dá)于結(jié)腸黏膜及黏膜下層。正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織NLRP3、Caspase-1 陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)，模型組小鼠結(jié)腸組織中可見(jiàn)大量NLRP3、Caspase-1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；高良姜素組NLRP3、Caspase-1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較模型組減少（均P<0.01）。美沙拉嗪組與高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組相比，NLRP3、Caspase-1 陽(yáng)性細(xì)胞率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)圖7。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3的表達(dá)（免疫組化法 ×400）

圖6 各組小鼠結(jié)腸組織中Caspase-1的表達(dá)（免疫組化法 ×400）

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織中NLRP3（A）、Caspase-1（B）表達(dá)量對(duì)比

5.小鼠血清中IL-1β、IL-18的含量

模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18 的含量較正常對(duì)照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。各治療組小鼠血清中IL-1β、IL-18 的含量較模型組均有不同程度下降。高良姜素組低于模型組（均P<0.05），美沙拉嗪組IL-1β、IL-18與高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。具體如表1。

表1 各組小鼠血清中IL-1β、IL-18的含量（ng/L，±s）

表1 各組小鼠血清中IL-1β、IL-18的含量（ng/L，±s）

注：每組6 只，分別為正常對(duì)照組、模型組、高良姜素組（40 mg·kg-1·d-1）、美沙拉嗪組（0.5 g·kg-1·d-1）、高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組（高良姜素40 mg·kg-1·d-1、美沙拉嗪0.5 g·kg-1·d-1），均按0.1 ml/10 g灌胃給藥。正常對(duì)照組小鼠自由飲用蒸餾水，無(wú)藥物干預(yù)；除對(duì)照組外，其余每組小鼠從造模第1天開(kāi)始自由飲用3.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液，同時(shí)給予藥物灌胃，每天1次，共7 d。IL為白細(xì)胞介素。與正常對(duì)照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01

IL-184.73±4.27117.20±8.87a 99.17±10.90b 80.67±14.22c 63.51±5.27c組別正常對(duì)照組模型組高良姜素組美沙拉嗪組高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組IL-1β 50.13±8.57133.20±13.81a 110.30±7.55b 88.81±11.49c 69.00±12.55c

討論

潰瘍性結(jié)腸炎作為一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，現(xiàn)有治療藥物只能做到臨床緩解，減少疾病復(fù)發(fā)，目前尚無(wú)有效的治愈手段，治療的目標(biāo)是誘導(dǎo)并維持癥狀緩解以及促使腸黏膜愈合，防治并發(fā)癥［10］。目前治療該疾病的藥物包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，然而這些藥物具有多種不良反應(yīng)，且疾病的復(fù)發(fā)率依舊偏高，有些患者甚至可能需要外科手術(shù)來(lái)治療［11］。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但炎癥卻始終伴隨著疾病的發(fā)生發(fā)展，其中免疫失調(diào)起到了重要作用。正常的腸道黏膜免疫機(jī)制可以抵御外界致病因子，并且對(duì)于維持腸道正常菌群具有重要作用，當(dāng)腸道免疫失調(diào)，腸黏膜屏障功能受損，相關(guān)致病因子會(huì)激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生多種致炎因子，誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建造3.5% DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過(guò)藥物干預(yù)，首先從實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況、體質(zhì)量、DAI 評(píng)分、結(jié)腸大體觀、組織病理等方面，觀察藥物對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠給予規(guī)定劑量的藥物干預(yù)后，其癥狀、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、HI評(píng)分均較模型組有不同程度改善，且高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪組治療效果更加顯著。所以，我們推測(cè)高良姜素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有一定的保護(hù)作用，并且聯(lián)合美沙拉嗪可能比單用美沙拉嗪治療效果更加顯著。

細(xì)胞焦亡在促進(jìn)炎癥發(fā)展方面有著重要作用，與細(xì)胞壞死和凋亡不同，細(xì)胞焦亡與NLRP3 炎性小體的激活密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NLRP3 炎性小體的激活和細(xì)胞焦亡參與了結(jié)腸炎的炎癥過(guò)程［12］。細(xì)胞焦亡作用是破壞病原體感染的細(xì)胞，使其更容易被吞噬細(xì)胞吞噬和殺滅，阻止病原體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［13］。然而，體內(nèi)細(xì)胞焦亡的異常激活可能導(dǎo)致各種炎性反應(yīng)從而導(dǎo)致各種炎癥性疾病。有研究表明，重癥肝炎和肝纖維化與肝細(xì)胞焦亡有關(guān)，其潛在機(jī)制可能是NLRP3炎性小體的異?；罨瘜?dǎo)致的［14］。肝臟X受體β與泛連接蛋白1相互作用，通過(guò)細(xì)胞焦亡的方式誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞死亡［13］。另有研究認(rèn)為，細(xì)胞焦亡可能在動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。腸道上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）是宿主細(xì)胞和腸道菌群之間的屏障，IECs 中過(guò)度的炎性小體激活會(huì)誘發(fā)細(xì)胞焦亡導(dǎo)致免疫系統(tǒng)和腸道菌群之間的平衡失調(diào)。因此，細(xì)胞焦亡在腸道上皮屏障功能障礙和黏膜炎癥的發(fā)展中有至關(guān)重要的作用。我們的實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞焦亡角度出發(fā)，以NLRP3、Caspase-1 為目標(biāo)分子，探究了細(xì)胞焦亡與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系，結(jié)果表明，模型組結(jié)腸組織中NLRP3 和Caspase-1 的表達(dá)量明顯增高（均P<0.01），經(jīng)高良姜素治療后它們的表達(dá)下降（均P<0.05），高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪相對(duì)于單用美沙拉嗪治療會(huì)進(jìn)一步下調(diào)NLRP3 和Caspase-1 的表達(dá)（均P<0.05）。由此可見(jiàn)，細(xì)胞焦亡的確存在于潰瘍性結(jié)腸炎中，并且高良姜素、美沙拉嗪對(duì)IECs細(xì)胞焦亡的抑制作用可能是其發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。針對(duì)炎癥性腸病IECs中細(xì)胞焦亡的免疫治療可能成為一種新的治療方法。

IL-1β 作為參與炎癥性腸病發(fā)病的最重要的促炎細(xì)胞因子之一，其產(chǎn)生依賴(lài)于炎性小體的激活，血漿中IL-1β 水平升高與腸道炎癥的嚴(yán)重程度和疾病活動(dòng)密切相關(guān)，并且通過(guò)藥物抑制IL-1β 可以成功改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的腸道炎癥［16-17］。IL-1β 可以誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖，參與黏膜損傷、感染，并促使中性粒細(xì)胞募集到損傷部位，進(jìn)一步激活NF-κB和MAPK 信號(hào)通路，促使其他炎性細(xì)胞因子釋放［18］。相關(guān)臨床研究表明，炎癥性腸病患者血清和結(jié)腸組織中IL-1β 含量顯著升高，在結(jié)腸炎動(dòng)物模型中，成熟IL-1β 的產(chǎn)生也顯著上調(diào)。與IL-1β 類(lèi)似，IL-18 也是由炎性小體激活的一種多功能細(xì)胞因子。IL-18通常是一種促炎介質(zhì)，它可能是炎癥性腸病患者的一個(gè)關(guān)鍵致病因素。Chaix 等［19］研究表明，從IECs 中敲除IL-18 受體基因?qū)SS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。IL-1β 和/或IL-18 基因缺乏小鼠對(duì)2，4-二硝基苯磺酸（DNBS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎也具有保護(hù)作用［20］。這些研究結(jié)果表明，IL-18的過(guò)量產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，從而加劇腸道炎癥。所以我們又進(jìn)一步檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)小鼠血清中IL-1β 和IL-18 的含量，同樣，模型組IL-1β 和IL-18 的含量顯著升高（均P<0.01），高良姜素治療后含量下降（均P<0.05），聯(lián)合美沙拉嗪治療后IL-1β、IL-18 的含量比單用美沙拉嗪更低（均P<0.05）。這兩種細(xì)胞因子的活化依賴(lài)于Caspase-1，而免疫組化中Caspase-1 的表達(dá)也與它們有相似的趨勢(shì)，這表明，高良姜素可能是NLRP3 炎性小體的抑制劑，使Caspase-1 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致GSDMD-N 形成減少，最終導(dǎo)致成熟的IL-1β 和IL-18 生產(chǎn)減少，從而減輕炎性反應(yīng)。同時(shí)，美沙拉嗪組小鼠NLRP3、Caspase-1 的表達(dá)也呈下降趨勢(shì)，我們推測(cè)，抑制細(xì)胞焦亡是美沙拉嗪發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。

綜上所述，高良姜素對(duì)DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，聯(lián)合美沙拉嗪保護(hù)作用更加明顯。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的產(chǎn)生，進(jìn)一步抑制細(xì)胞焦亡，減少I(mǎi)L-1β 和IL-18的釋放，從而減輕腸道炎癥。我們還發(fā)現(xiàn)，高良姜素聯(lián)合美沙拉嗪比單用美沙拉嗪治療效果更加，二者聯(lián)合會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的治療效果，所以美沙拉嗪聯(lián)合高良姜素可能成為臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的新方法。我們的研究初步闡述了高良姜素與NLRP3 炎性小體、細(xì)胞焦亡的關(guān)系，為臨床潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突