激活轉錄因子2、胱天蛋白酶9在結直腸腺瘤、結直腸癌中的表達及意義△

田二青，任麗梅，武金寶，王馳，蘇琪皓，劉中華

1內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040

2包頭醫學院第二附屬醫院消化科，內蒙古 包頭 014031

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤[1]，近年來，其發病率和病死率分別居所有腫瘤的第二位和第五位[2]，并且逐漸呈年輕化趨勢[3]。有40%的CRC 患者行結直腸癌切除術后因病情惡化、復發導致死亡[4]。CRC 的發生涉及多種致病機制，包括基因融合、遺傳不穩定性、體細胞突變等[5-6]，目前尚未完全明確。結直腸腺瘤（colorectal adenomas，CRA）被認為是一種重要的癌前病變，90%以上的CRC 由CRA 發展而來，且從癌前病變發展到腫瘤通常需要5～10年[4]。激活轉錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）是一種應激誘導型轉錄因子，不僅在細胞核中起到致癌作用，還在細胞質中起到抑癌作用，作用機制為通過線粒體凋亡通路激活胱天蛋白酶9（caspase 9）的活性，從而促進細胞凋亡。目前，關于ATF2和caspase 9 在CRA 和CRC 中表達的報道很少。本研究檢測ATF2 和caspase 9 在CRC 組織、CRA 組織和癌旁組織中的表達水平，并分析其與CRC 患者臨床特征的關系，進而探討ATF2 和caspase 9 在CRC 中的致病機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2022年1月包頭醫學院第二附屬醫院收治的CRC、CRA 患者的病歷資料。納入標準：經病理學檢查確診；術前無任何放化療等抗腫瘤治療；臨床資料完整。排除標準：合并其他腫瘤；合并心、肝、腎功能障礙或其他嚴重基礎疾病。根據納入、排除標準，共納入50 例CRC 患者和30 例CRA 患者。CRC 患者中，男性23 例，女性27 例；年齡36～88 歲，平均（51.46±7.38）歲；分化程度：高分化19 例，中+低分化31 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期27 例，Ⅲ+Ⅳ期23 例；浸潤深度：肌層以內22 例，漿膜及漿膜外28 例；淋巴結陽性19 例，淋巴結陰性31 例。CRA 患者中，男性13 例，女性17 例；年齡32～84 歲，平均（49.32±7.19）歲；管狀腺瘤9例，絨毛狀腺瘤13 例，管狀絨毛狀腺瘤8 例。CRC和CRA 患者年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。取50 例CRC 患者的CRC 組織及對應癌旁組織（距離病灶邊緣10 cm 以上）、30 例CRA 患者的CRA 組織。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化檢測方法

兔抗人ATF2、caspase 9 多克隆抗體均以1∶300比例稀釋，將蠟塊切成4 μm 厚的切片，然后依次行烤蠟、水化、抗原修復、PV 二步法染色、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、二甲苯透明和封片等操作。操作步驟按照試劑盒說明書。

1.3 結果判斷

由兩位病理科醫師采用雙盲法獨立完成閱片及評分，每張切片隨機選擇5 個高倍鏡視野（×400）觀察，根據染色強度和陽性細胞百分比評分。染色強度評分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，黃褐色為3 分；陽性細胞百分比評分：＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。兩項評分的乘積≥3 分為陽性（+）。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 相關分析；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATF2 和caspase 9 表達情況的比較

ATF2主要表達于細胞質和/或細胞核，caspase 9主要表達于細胞質。CRC 組織中ATF2、caspase 9陽性表達率均低于CRA 組織和癌旁組織，CRA 組織中caspase 9 陽性表達率低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 CRC 組織、CRA 組織和癌旁組織中ATF2、caspase 9表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤大體分型及病理類型CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。浸潤深度為肌層以內、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移CRC 患者CRC 組織中ATF2 陽性表達率分別高于浸潤深度為漿膜及漿膜外、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；分化程度為高分化、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移CRC 患者CRC 組織中caspase 9 陽性表達率分別高于分化程度為中+低分化、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 表達情況的比較

2.3 CRC組織中ATF2與caspase 9表達的相關性

Spearman 相關分析顯示，CRC 組織中ATF2 與caspase 9 的表達呈正相關（r=0.418，P=0.003）。

3 討論

ATF2 是激活蛋白-1 轉錄復合物中的一種重要成分，作為一種轉錄因子，在調節細胞生長發育、細胞應激、細胞周期及細胞凋亡等過程中發揮作用。研究顯示，在應激刺激下，ATF2 可定位于細胞核中，激活多種基因靶點，包括細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白D 和c-Jun，在各種組織類型的腫瘤中發揮致癌作用，如惡性黑色素瘤、前列腺癌、神經系統腫瘤、肝癌等。但也有越來越多的證據表明，ATF2 定位于細胞質，如非惡性皮膚癌中，與腫瘤抑制作用有關。已有研究利用缺失ATF2的小鼠的表皮基底層細胞進行研究，發現ATF2 轉錄活性的缺失可促進皮膚乳頭狀瘤的形成[7]。研究表明，ATF2發揮致癌作用或抑癌作用的根本原因可能與其亞細胞定位相關，主要受蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）的調節。PKCε可結合ATF2 的T52，使其發生磷酸化修飾，并使ATF2 定位于細胞核，發揮致癌作用。當細胞外界及自身發生變化后，PKCε作用減弱，ATF2 的T52 磷酸化水平降低，從而使ATF2 定位在線粒體并干擾含有己糖激酶1（hexokinase 1，HK1）和電壓依賴性陰離子通道1（voltage dependent anion channel 1，VDAC1）的高階復合物的形成，導致線粒體通透性轉換孔長時間開放，同時ATF2 向線粒體的募集也可引起膜電位降低、細胞色素C 滲漏等，這些都將激活線粒體凋亡通路引發細胞凋亡[8-9]。本研究結果顯示，CRC組織中ATF2 陽性表達率低于CRA 組織和癌旁組織，提示ATF2 的異常表達發生于癌前病變，若阻斷其在線粒體中的定位可抑制CRC 的發生。進一步的研究發現，ATF2 的陽性表達率受腫瘤浸潤深度、TNM 分期和淋巴結轉移情況的影響，在浸潤深度越深、TNM 分期越高和有淋巴結轉移的患者中ATF2 陽性表達率越低。說明ATF2 的異常表達與CRC 的發生、侵襲、轉移相關。

caspase 9 是一種啟動型caspase，處于級聯反應的上游，由凋亡肽酶激活因子1（apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1）、細胞色素C 和dATP 組成的凋亡體激活，觸發內源性細胞凋亡[10]。細胞凋亡是一個高度組織化的程序性細胞死亡過程，對器官發育、組織重塑、免疫反應和腫瘤抑制至關重要[11-12]。異常的細胞凋亡被認為有助于腫瘤的發生和進展。隨著對caspase 9 的不斷研究，發現caspase 9 在許多腫瘤中低表達，與腫瘤的浸潤和轉移密切相關[13]。本研究發現，CRC 組織中caspase 9 陽性表達率低于CRA 組織和癌旁組織，CRA 組織中caspase 9 陽性表達率低于癌旁組織，提示caspase 9表達下調時，降低了腫瘤細胞的凋亡水平，導致CRC 的發生和發展。此外還發現，caspase 9 的陽性表達率與分化程度、TNM 分期和淋巴結轉移情況有關。這表明caspase 9 的表達與腫瘤的增殖水平和惡性程度有一定的關系，可能在CRC 發展和惡化的某些階段起作用，與趙巖等[14]的研究結果一致。

本研究發現，ATF2 和caspase 9 主要表達于細胞質，而在細胞核中的表達則較為分散，在CRC 組織中均表達下調。Spearman 相關性分析顯示，CRC 組織中ATF2 與caspase 9 表達呈正相關，這也許說明在CRA 惡變過程中，ATF2 可能通過線粒體凋亡通路調控caspase 9 表達，在CRC 的進展中發揮重要作用。雖然ATF2 在細胞質中通過促進細胞凋亡發揮抑癌作用，但其核輸出和線粒體定位的精確機制仍有待研究。且本研究僅通過免疫組化法進行檢測，有必要進一步通過細胞學實驗或結合其他相關因素對該結果進行進一步的分析及驗證。ATF2 作為腫瘤治療中的一個重要分子靶點，抑制其核內轉錄功能，增強其細胞質內定位，可作為今后CRC 治療的策略之一，為靶向精準治療開辟新途徑。