葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證試驗設(shè)計

張莉華，呂紅萍，陳少軍，王勝南，劉愛琴，許新德,

1. 浙江藥科職業(yè)大學(xué)（寧波 315100）；2. 浙江可明生物醫(yī)藥有限公司（新昌 312500）；3. 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠（新昌 312500）

高職本科教學(xué)旨在培養(yǎng)高層次技術(shù)技能型人才，更加注重實踐和應(yīng)用能力的培養(yǎng)，而試驗教學(xué)是人才培養(yǎng)的重要組成部分，是培養(yǎng)學(xué)生實踐應(yīng)用能力的重要手段[1-2]。試驗教學(xué)不僅能加深對專業(yè)知識的理解，更重要的是培養(yǎng)學(xué)生運用所學(xué)知識和方法解決實際工作問題的能力，如試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和計算，以及通過合理有效的綜合分析得出正確的結(jié)論等。

具體到高職本科食品營養(yǎng)與健康專業(yè)的功能性食品開發(fā)與評估試驗課程，設(shè)計具有專業(yè)特色的功效成分含量測定方法學(xué)驗證綜合試驗——葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證試驗設(shè)計。葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界中，而商品化的葉黃素主要從萬壽菊花中提取分離制得[3-4]。葉黃素具有營養(yǎng)和著色的雙重功能[4]，在緩解視疲勞[5-8]、抗氧化[9-10]功能食品中被廣泛應(yīng)用。葉黃素功能性軟糖[3,6]、乳飲料[5]、軟膠囊[7,9]、顆粒[8,10]、片劑[11-12]制備及評價研究較多，但關(guān)于功效成分含量測定的方法學(xué)驗證試驗設(shè)計鮮有報道。

結(jié)合專業(yè)課程建設(shè)整體安排，設(shè)計葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證綜合試驗，進行專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等的方法學(xué)考察，探討紫外-可見分光光度法測定葉黃素咀嚼片中葉黃素含量的可行性，為葉黃素咀嚼片質(zhì)量控制和功效成分含量的測定奠定基礎(chǔ)。通過方法學(xué)驗證過程中的驗證方案設(shè)計、驗證試驗操作及對試驗結(jié)果的分析討論，幫助學(xué)生掌握方法學(xué)驗證的思路、內(nèi)容和過程，并培養(yǎng)學(xué)生運用所學(xué)知識解決實際問題的能力、交流合作和探索意識。

1 葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證試驗方案設(shè)計

將企業(yè)產(chǎn)品檢測方法學(xué)驗證項目轉(zhuǎn)化為本科生綜合設(shè)計試驗，可作為高職本科三年級食品營養(yǎng)與健康專業(yè)學(xué)生的功能性食品開發(fā)與評估綜合實訓(xùn)試驗內(nèi)容，試驗學(xué)時設(shè)計為12學(xué)時。葉黃素咀嚼片是以葉黃素微粒為主要原料，輔以木糖醇、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、硬脂酸鎂，經(jīng)混合、制粒、干燥、壓片等工藝制成的經(jīng)人體試食試驗證明具有緩解視疲勞功能的保健食品，其功效成分葉黃素含量為2.22%。由于該產(chǎn)品功效成分檢驗方法沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，需要建立該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需要對所建立的方法進行驗證，說明所建立的方法適合于該產(chǎn)品的檢測要求，能用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

試驗前，教師指導(dǎo)學(xué)生利用學(xué)校圖書館和線上資源查找相關(guān)文獻、整理相關(guān)資料，制定方法學(xué)驗證方案，幫助學(xué)生熟悉和掌握含量測定方法學(xué)驗證的目的、內(nèi)容和指標(biāo)限定要求。2～3名學(xué)生為1組，全部學(xué)生分成多個小組，以學(xué)生為主，在教師輔導(dǎo)下撰寫、修改完善試驗方案。葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法參考浙江制造團體標(biāo)準(zhǔn)T/ZZB 0405——2018《復(fù)配食品添加劑 葉黃素微粒》[13]中葉黃素含量測定方法確定，采用紫外-可見分光光度法測定葉黃素咀嚼片中葉黃素的含量，確定驗證方案中方法學(xué)驗證項目[14-15]包括專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等，具體方法學(xué)考察項目見表1。

表1 葉黃素含量測定的方法學(xué)考察項目安排

2 葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證試驗實施[13-14]

葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證方案采用2～3名學(xué)生為1組，全班學(xué)生分成多個小組的方式來進行驗證實施，利用紫外-可見分光光度法分別探討葉黃素咀嚼片中功效成分葉黃素含量測定方法的專屬性、線性及范圍、精密度、準(zhǔn)確度、溶液穩(wěn)定性。驗證試驗實施過程包括溶液的配制、分光光度法測試、數(shù)據(jù)處理與分析、試驗報告等多個環(huán)節(jié)，此過程通過實踐讓學(xué)生進一步掌握含量測定方法學(xué)驗證的思路和內(nèi)容、驗證過程和結(jié)果的評價。試驗過程中需要小組學(xué)生之間分工與協(xié)作，在試驗數(shù)據(jù)處理與分析中需要學(xué)生之間的交流與合作，因此試驗也訓(xùn)練了學(xué)生綜合運用所學(xué)知識解決實際問題的能力，在實踐中交流合作，科學(xué)探索。

2.1 葉黃素咀嚼片中功效成分葉黃素的測定方法

2.1.1 供試品溶液的制備

取3片葉黃素咀嚼片，研磨碎后，準(zhǔn)確稱取約450 mg（相當(dāng)于10 mg葉黃素）供試品置于100 mL容量瓶中，加5 mL純化水，在60 ℃水浴中超聲溶解5 min，用冷卻水冷卻至室溫，無水乙醇稀釋定容至刻度，搖勻。過濾，棄去最初的2 mL濾液。吸取1 mL上述過濾液于50 mL容量瓶中，無水乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2 測定

用1 cm石英比色杯，以無水乙醇作為空白，在最大吸收波長446 nm處測定供試品溶液的吸光度A，按式（1）計算葉黃素咀嚼片中葉黃素的含量（T，%）。

式中：A為供試品溶液的吸光度；W為稱取供試品量，g；2 550為葉黃素的吸收系數(shù)；5 000為稀釋倍數(shù)。

2.2 葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證試驗過程

2.2.1 專屬性

專屬性主要考察試劑、輔料存在下，采用的檢測方法能否正確測定出功效成分的能力。小組內(nèi)學(xué)生分工協(xié)作按照2.1項測試方法配制試劑空白、1.5倍空白輔料（精確稱取675 mg空白輔料）溶液、對照品溶液、供試品溶液，用1 cm石英比色杯，以無水乙醇作為空白，分別記錄400～500 nm掃描圖（見圖1）。結(jié)果表明，空白輔料樣品、試劑空白在446 nm處均無吸收峰；供試品溶液和對照品溶液的譜圖峰形相似且在446 nm均有最大吸收峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 葉黃素含量測定專屬性結(jié)果

2.2.2 線性

線性是測試在設(shè)計的范圍（相對濃度70%，90%，110%，130%和160%）內(nèi)，線性試驗結(jié)果與試樣中功效成分葉黃素濃度直接呈比例關(guān)系的能力。采用同一對照品儲備液經(jīng)精密稀釋制備5個不同濃度水平的方法來觀察是否線性，并進行線性回歸。

精確稱取20 mg葉黃素工作標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL棕色容量瓶中，加20 mL無水乙醇，在60 ℃水浴中超聲溶解5 min，用冷卻水冷卻至室溫，無水乙醇稀釋定容至刻度，搖勻。吸取10 mL上述溶液置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度20μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取0.7，0.9，1.1，1.3和1.6 mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，制得相對濃度為70%（1.4 μg/mL），90%（1.8 μg/mL），110%（2.2μg/mL），130%（2.6 μg/mL）和160%（3.2 μg/mL）的對照品溶液。按照2.1的測試方法測定其吸光度，以所測得的吸光度為縱坐標(biāo)，以溶液中葉黃素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程式及相關(guān)系數(shù)（r）和Y軸偏差（見表2）。從線性考察可知，葉黃素的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)（r）和Y軸偏差均符合表1中r≥0.999、Y軸偏差≤0.050的要求。由此可見，葉黃素含量測定方法在1.4～3.2 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表2 葉黃素含量測定線性關(guān)系考察結(jié)果

各個品牌的分光光度計測試吸光度的原理和過程都一樣，每個儀器的操作又略有不同，有些學(xué)生操作儀器時還是無從下手。為此，通過超星學(xué)習(xí)通平臺上傳分光光度計的操作視頻，供學(xué)生自主學(xué)習(xí)和課后復(fù)習(xí)，學(xué)生可以隨時反復(fù)觀看，強化知識和技能。另外，試驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備要求學(xué)生通過Excel軟件進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，但一部分學(xué)生無法正確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算相關(guān)系數(shù)（r）和Y軸截距，除了通過課堂現(xiàn)場演示教學(xué)外，建議還可以編寫新形態(tài)綜合實訓(xùn)教材，將Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過程制作成二維碼，學(xué)生隨時掃碼學(xué)習(xí)和復(fù)習(xí)。通過多種方式讓學(xué)生在線性測試過程中不僅掌握分光光度計的測試原理和操作使用，還學(xué)會正確使用Excel軟件進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與評價。

2.2.3 精密度

含量測定需要考察方法的精密度。精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一份樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等表示。試驗進行重復(fù)性和中間精密度測定。在相同條件下，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一實驗室內(nèi)，由不同人員、在不同時間、不同設(shè)備等測定結(jié)果之間的精密度稱為中間精密度。精密度測試小組成員扮演分析員甲和乙，分別在規(guī)定條件下、規(guī)定濃度用至少6份樣品的測試結(jié)果進行評價。

重復(fù)性（分析員甲）：精密稱取6份葉黃素咀嚼片樣品450 mg至100 mL棕色容量瓶中，按照2.1的測試方法測定其吸光度，計算樣品中葉黃素含量和SRSD（見表3）。

表3 葉黃素含量測定重復(fù)性考察結(jié)果

中間精密度（分析員乙）：在不同的日期，分別精密稱取6份450 mg同批次葉黃素咀嚼片樣品至100mL棕色容量瓶中，按照2.1的測試方法測定其吸光度，計算樣品中葉黃素含量和SRSD。不同分析員測定結(jié)果相比較，計算其SRD（見表3）。

重復(fù)性（分析員甲）測試中含量SRSD=1.0%（n=6），中間精密度（分析員乙）測試中SRSD=0.9%（n=6），不同分析員測試結(jié)果SRD=4.5%，均符合表1中SRSD≤2.0%，SRD≤5.0%的要求，說明葉黃素含量測定方法的精密度良好。

精密度考察中SRSD計算是一個難點，可通過將復(fù)雜的計算過程制作成微課以二維碼在教材或?qū)W習(xí)通線上資源的形式呈現(xiàn)，將復(fù)雜的計算過程以直觀易懂的方式傳授給學(xué)生，并學(xué)以致用。

2.2.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是指所建立方法測定的結(jié)果與真實值的接近程度，一般用回收率（%）表示。試驗中采用規(guī)定檢測濃度的70%，100%和130%，一式三份，以在空白輔料中加入已知量功效成分對照品進行測定。

精密稱取約50 mg葉黃素對照品至50 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為準(zhǔn)確度測試儲備液。精密稱取450 mg空白輔料，共9份，分別加入7.0，10.0和13.0 mL的準(zhǔn)確度測試儲備液，按照2.1.1的方法制備供試品溶液，制得檢測濃度70%，100%和130%的準(zhǔn)確度測試加標(biāo)溶液。按照2.1.2的方法測定其吸光度，計算加標(biāo)回收率和SRSD（見表4）。

表4 葉黃素含量測定準(zhǔn)確考察結(jié)果

準(zhǔn)確度測試中平均回收率為99.6%，SRSD=0.4%（n=9），回收率和平均回收率均在95.0%～105.0%之間，符合表1中回收率在95.0%～105.0%之間，SRSD≤2.0%的要求，表明葉黃素含量測定方法的回收率好、準(zhǔn)確度高。

2.2.5 溶液穩(wěn)定性

按照2.1.1的方法配制供試品溶液1份，常溫放置，分別在配制后0，2，4，6和8 h按照2.1.2的測試方法測定其吸光度，計算葉黃素含量，并與0 h測定結(jié)果相比較，計算其SRD（見表5）。由溶液穩(wěn)定性測試結(jié)果可知，溶液放置2，4，6和8 h后含量與新鮮配制溶液（0 h）含量的SRD均小于5.0%，符合表1中穩(wěn)定性的要求，說明葉黃素含量測定方法具有良好的穩(wěn)定性。溶液穩(wěn)定性測試需要進行8 h，所以整個試驗的時間安排上也要做好整體規(guī)劃。

表5 溶液的穩(wěn)定性測試結(jié)果表

2.3 課后試驗拓展

試驗采用吸收系數(shù)法進行葉黃素咀嚼片中功效成分葉黃素含量測定的方法學(xué)驗證，進行專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度和溶液穩(wěn)定性等項目的考察測試，內(nèi)容豐富，綜合性強。在此基礎(chǔ)上，可對試驗進行進一步的拓展，可通過查資料進一步探索采用HPLC法測定葉黃素咀嚼片中功效成分含量測定方法學(xué)驗證指標(biāo)和過程。HPLC法進行含量測定的方法學(xué)驗證在此試驗考察項目的基礎(chǔ)上，還要增加檢測限、定量限、耐用性等測試，請學(xué)生課后設(shè)計相關(guān)的測試考察過程，激發(fā)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)能力和思維拓展，舉一反三加深學(xué)生對方法學(xué)驗證的理解和經(jīng)驗積累。

3 結(jié)語

試驗以紫外-可見分光光度法定量分析中的吸收系數(shù)法進行葉黃素咀嚼片中功效成分葉黃素含量測定方法的驗證試驗設(shè)計，通過對專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度和溶液穩(wěn)定性等指標(biāo)的考察，證明葉黃素咀嚼片中功效成分葉黃素含量測定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可用于葉黃素咀嚼片質(zhì)量控制和功效成分含量的測定。該試驗教學(xué)模式集含量測定方法學(xué)驗證理論學(xué)習(xí)、試驗操作、數(shù)據(jù)處理與分析為一體，提升學(xué)生綜合運用所學(xué)知識解決實際問題的能力，為后續(xù)深造、畢業(yè)后從事相關(guān)工作打下堅實基礎(chǔ)。