基于網絡藥理學和分子對接分析舒血寧注射液治療急性腦梗死的作用機制*

馮菲,馬靜,李春曉,李春蘭,謝薇

1.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450000; 2.河南省中藥臨床應用、評價與轉化工程研究中心,河南 鄭州 450000;3.河南省中藥臨床藥學中醫藥重點實驗室,河南 鄭州 450000

近年來,腦血管疾病在老年人群的患病率逐漸提高。該病具有較高的致殘率、病死率和復發率,嚴重影響人們健康和生活水平[1]。我國急性腦梗死占全部腦卒中發病率的70%[2]。因此,探索急性腦梗死的快速診斷、有效治療方法成為臨床科研的重中之重。舒血寧注射液主要成分為銀杏葉,每片含總黃酮2 mg。其功能為活血化瘀、通脈舒絡、益氣健腦。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點[3]。網絡藥理學是系統生物學的理論,從另一角度解釋中藥多成分、多靶點協同作用的問題,使中藥藥物研發具有可預測性[4]。本文根據世界中醫藥學會聯合會發布的《網絡藥理學評價方法指南》[5],利用網絡藥理學研究舒血寧注射液主要成分——銀杏葉治療急性腦梗死的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉化合物與靶標獲取運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取銀杏葉相應的化合物。以口服利用度(oral bio-availability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18、半衰期(half-life,HL)≥4 h為條件進行化合物篩選。同時在TCMSP中尋找篩選出來化合物的Pubchem ID號,進入數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),搜索Canonical SMILES后進入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/),統一轉化成基因名稱。

1.2 急性腦梗死基因獲取以“Acute Cerebral Infarction”為關鍵詞從GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫搜索與急性腦梗死有關的基因,刪除重復基因和假陽性基因,與銀杏葉成分基因進行匹配,搜集兩數據的交集,在韋恩圖在線繪制平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行可視化。

1.3 構建“中藥-化合物-交集靶點”網絡圖將銀杏葉有效成分、有效成分所對應的靶點以及急性腦梗死疾病對應的靶點輸入Cytoscape3.9.1軟件,構建“中藥-化合物-交集靶點”網絡圖。在網絡圖中,節點(node)代表藥物以及其有效活性成分、疾病、靶點等;邊(edge)分別代表藥物與活性成分、活性成分與活性成分作用靶點、疾病與活性成分作用靶點等之間的相互關系。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡圖構建將銀杏葉-急性腦梗死共同作用靶點的基因導入STRING數據庫(https://string-db.org/),獲取PPI關系,分值越高說明PPI置信度越高,數據可靠性越高。將所得數據導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化,繪制PPI網絡圖。

1.5 富集分析將關鍵靶點基因輸入Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),對銀杏葉作用靶點進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析,選擇生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)3個模塊;進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KECG)通路富集分析,以闡釋舒血寧注射液治療急性腦梗死的生物功能及相關信號通路。

1.6 分子對接最終篩選出20種活性成分與靶蛋白基因進行DockThor在線(https://dockthor.lncc.br/v2/)分子對接[6]。篩選出來的活性成分在 Pubchem數據庫中下載其3D結構,將拓撲性質排名前5位的靶蛋白基因從PDB數據庫中下載核心靶點蛋白質結構,將配體與受體輸入到Dockthor在線分子對接平臺中。利用Autodock Tools 1.5.6軟件進行分子對接。最后采用PyMol 2.4軟件實現對接結果可視化,建立對接相互作用模式圖。

2 結果

2.1 舒血寧注射液-銀杏葉主要成分檢索TCMSP數據庫,共收集307種活性成分,再以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h作為篩選參數,最終篩選出24種活性成分,見表1。

表1 舒血寧注射液藥中銀杏葉活性成分

2.2 舒血寧注射液-急性腦梗死共同靶點的篩選在Genecards數據庫中以“Acute Cerebral Infarction”為關鍵詞進行搜索,發現3 548個潛在作用靶點的基因。在韋恩圖在線繪制平臺中分別錄入銀杏葉對應的443個靶點對應的基因與急性腦梗死的 3 548 個基因,繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點288個,見圖1。

圖1 舒血寧注射液與急性腦梗死交集靶點韋恩圖

2.3 構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡構建并分析使用Cytoscape 3.9.1軟件靶點網絡圖,紅色代表銀杏葉,橙色代表銀杏葉主要的成分,綠色代表舒血寧注射液與急性腦梗死疾病相交靶點,并根據Degree值進行分析,度值越高,說明其在網絡中越重要。結果顯示銀杏內酯(Bilobalide)、芝麻素(sesamin)、異鼠李素(isorhamnetin)等在網絡中排名較高,可認為是舒血寧注射液治療急性腦梗死的主要的活性成分,見圖2。

圖2 急性腦梗死與銀杏葉的“中藥-化合物-交集靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡圖將銀杏葉對應的靶點基因與疾病對應的靶點基因的所得交集基因輸入STRING數據分析平臺,分析下載其關系表格后,根據關聯分數≥0.8進行篩選,再運用cytoscape 3.9.1軟件繪制PPI網絡圖,見圖3。得到互作關系排名前5位的蛋白為PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3。急性腦梗死與銀杏葉的關鍵靶點及其拓撲性質見表2。

圖3 PPI網絡圖

表2 急性腦梗死與銀杏葉的關鍵靶點及其拓撲性質

2.5 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析將288個共同靶點導入DAVID數據庫進行GO功能富集分析,獲得GO條目1 281個(P<0.05),分別包括BP 950個,MF 222個,CC 109個;其中包括細胞對氮化合物的反應、蛋白質磷酸化、系統過程調節、MAPK的正調節、對無機物質的反應、炎癥反應、細胞對有機環狀化合物的反應等。GO條目之間關系及柱狀圖見圖4。

圖4 銀杏葉藥物活性成分作用急性腦梗死靶點的GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共富集178個條目(P<0.05),篩選排名靠前的20個條目進行可視化分析,繪制條目之間關系圖及柱狀圖,見圖5。主要包括癌癥通路、刺激神經組織的中的交互作用、cAMP信號通路、蛋白聚糖在癌癥中的應用、TRP通道的炎癥介質調節、磷脂酶D信號通路等,見表3。

圖5 銀杏葉藥物活性成分作用急性腦梗死靶點的KEGG通路富集分析

表3 舒血寧注射液治療急性腦梗死的KEGG通路富集分析結果

2.6 分子對接在TCMSP數據庫中最終篩選出20種活性成分與靶蛋白基因進行對接,DockThor在線對接[6]結果具體信息見表4。以Bilobalide為例,與EGFR、PIK3R1用Autodock Tools 1.5.6軟件進行作用分析,然后將化合物與關鍵靶點的相互作用模式用PyMol2.4軟件進行展示見圖6。

圖6 活性成分Bilobalide與關鍵靶點的分子對接圖

表4 主要化學成分與主要靶蛋白的結合能

3 討論

作為神經內科常見病、多發病之一的急性腦梗死嚴重影響人們的生活質量[7-8]。目前,急性腦梗死的發病機制尚未完全闡明,大多認為其與血液高凝狀態、血液流變學、動脈粥樣硬化、側支循環血管阻塞及糖尿病等關系密切[9-10]。如何治療及預防急性腦梗死的發生,在降低致死率、致殘率及提高患者生活質量方面有重要意義。中醫藥能從整體觀的角度分析中藥成分靶點與疾病靶點之間的作用關系,初步探討其治療疾病的內在機理[11]。本研究基于網絡藥理學,探究舒血寧注射液的主要中藥成分——銀杏葉治療急性腦梗死的治療機制。

采用TCMSP數據庫對舒血寧注射液的主要中藥成分進行篩選,篩選出銀杏葉的主要活性成分為24種,根據與急性腦梗死相關靶點的分析得知,銀杏內酯(Bilobalide)、芝麻素(sesamin)、β-谷甾醇(isorhamnetin)是與急性腦梗死相關靶點作用最多的化學成分。有學者表示,銀杏內酯注射液可減輕神經功能損傷,調節血脂,提高抗氧化能力[12]。β-谷甾醇具有較強的抗炎作用[13]。有研究表明,β-谷甾醇具有較好的降脂作用,可降低機體對膽固醇、膽汁酸和膳食脂質的吸收與再吸收,患者身體吸收β-谷甾醇后可有效預防動脈粥樣硬化[14]。芝麻素能降低神經元損傷,保護神經元[15]。另外,銀杏葉主要活性成分相關靶點共有443個,急性腦梗死的相關靶點共有3 543個,兩者通過PPI網絡分析得出其相交靶點共有288個,通過對急性腦梗死與銀杏葉相關交集靶點進行拓撲性質,其中排名前5位的蛋白為PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3。PIK3R1的高表達可以抑制炎性因子的產生,通過下調PIK3R1,可產生炎性因子IL-1β、IL-18,進而增高細胞的凋亡率[16]。有研究表明,通過下調SRC的表達,可促進ZO-1的表達,起到腦保護的作用[16]。研究顯示,MAPK1是TNF信號通路和氧化應激相關的關鍵基因之一,在誘發腦出血中起到重要作用[17]。EGFR是一種生長因子受體,通過其配體的結合激活后,可誘導細胞分化和增殖。受體位于細胞表面,配體的結合激活受體細胞內區域的酪氨酸激酶。這種酪氨酸激酶磷酸化了許多細胞內底物,激活了細胞生長、DNA合成[18]。STAT3作為轉錄調節因子,在發育和成熟組織功能中具有關鍵作用,包括控制炎癥和免疫應答[19]。STAT3在細胞刺激下調控多種基因的表達,在細胞生長和凋亡中起關鍵作用[20],最終達到腦保護的作用。

通過對相關靶點的通路分析,結果發現主要包括cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、磷脂酶D信號通路(Phospholipase D signaling pathway)等。cAMP是一種普遍存在的第二信使,調節細胞遷移、分化、增殖和凋亡等許多生物學過程。cAMP信號是維持線粒體穩態、調節線粒體動力學、調節細胞應激反應等信號通路不可或缺的組成部分[21]。磷脂酶D1(phospholipase D1,PLD1)在多種細胞功能的調節中發揮重要作用,如細胞生長、存活、分化、膜運輸和細胞骨架組織[22]。

DockThor在線分子對接結果中發現,根據結合能的數值推出,篩選出來的20種主要活性成分均能與互作關系排名前5位的蛋白(PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3)結合并形成氫鍵。當結合能小于0時,蛋白和小分子便可以自發地進行結合。分子對接結果表明,經TCMSP數據庫篩選得到的20種化合物與靶蛋白結合的結合能都遠小于0。

綜上所述,舒血寧注射液主要中藥成分——銀杏葉能夠起到抗炎、抗氧化、神經保護等多種藥理作用,但仍有一定局限性,所得結論仍需通過實驗或臨床研究進行印證。