羥基紅花黃色素A對MCAO大鼠腦組織XIAP蛋白及細胞凋亡的調節作用

郭莉琛,杜鑫苑,許海英,梁冰,張彤,袁慶,胡利民

天津中醫藥大學中醫藥研究院/組分中藥國家重點實驗室/天津市中藥藥理學重點實驗室/方劑學教育部重點實驗室,天津 301617

缺血性腦卒中是臨床常見的一種卒中類型,具有發病率高、致殘率高、病死率高的特點[1]。目前,缺血性腦卒中的治療方法主要為藥物溶栓和機械取栓,但伴隨著治療窗窄、出血并發癥風險高等限制因素,因此,探索新的有效緩解腦缺血損傷的藥物成為當務之急。中藥紅花是菊科植物紅花的干燥花,性辛、溫,歸心、肝經,具有活血通經,散瘀止痛之效[2]。現代藥理研究表明,羥基紅花黃色素A作為中藥紅花的主要活性成分,在調節氧化應激、炎癥反應、糖脂代謝、血管功能方面發揮重要作用,在治療心腦血管疾病方面有廣闊的應用前景[3-6]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族中抑制Caspase 活性能力最強的因子,是調節細胞凋亡的重要蛋白[7]。研究表明,XIAP參與凋亡、自噬、焦亡等多種細胞程序性死亡方式的調節[8-10]。缺血性腦卒中發生后,由于供血不足能量代謝異常引發的一系列級聯反應造成細胞大量死亡,因此,細胞凋亡機制的調節對疾病的治療有重要意義[11]。目前,內源性XIAP在缺血性腦卒中中的細胞凋亡調節機制尚不明確。本文以細胞凋亡為出發點,研究羥基紅花黃色素A對腦缺血后XIAP蛋白的調節作用及細胞凋亡的影響,以探討羥基紅花黃色素A治療缺血性腦卒中的可能機制。

1 材料

1.1 動物75只SPF級Wistar雄性大鼠,體質量250～280 g,購自北京維通利華實驗動物公司,許可證號:SCXK(京)2021-0006,飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心,自由進食進水,室溫20～25 ℃,相對濕度56%～60%。動物實驗獲得天津中醫藥大學倫理委員會批準(審批號:TCM-LAEC2022119)。

1.2 藥物與試劑羥基紅花黃色素A(廣州悅康生物制藥有限公司,規格:25 mg/瓶,批號:200901);B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、Bcl-2同源二聚體X(Bcl-2-Associated X,Bax)抗體、β-actin抗體(英國Abcam公司,貨號:ab196495、ab199677、ab179467);Caspase-3抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:9662S);XIAP抗體(美國Bioworld公司,貨號:CAS75122);HE染色試劑盒及Nissl染色試劑盒、RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:C0105、G1430、R0020);TUNEL凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C1088);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒(羥胺法)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(TBA法)(南京建成生物工程研究所,貨號:A001-1、A003-1);2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC,美國Sigma-Aldrich公司,貨號:T8877)。

1.3 儀器HCM100-Pro型恒溫震蕩金屬浴(大龍實驗儀器公司);1658001型Western-blot電泳儀(美國Bio-Rad公司);trans-blot?型轉膜儀(美國Invitrogen 公司);RM2135型病理切片機、Leica 750型生物顯微鏡(德國LEICA公司);Amersham imager 600型超靈敏多功能成像儀(美國General Electric 公司);Eclipse Ti型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);FlexStation3型多功能酶標儀(美國MD公司)。

2 方法

2.1 動物分組、建模及給藥成年健康Wistar大鼠隨機分為假手術組、永久性大腦中動脈梗塞模型組(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)、羥基紅花黃色素A低劑量組(2.5 mg·kg-1)、羥基紅花黃色素A中劑量組(5.0 mg·kg-1)、羥基紅花黃色素A高劑量組(7.5 mg·kg-1),每組15只。除假手術組外,其余大鼠建立永久性大腦中動脈梗塞模型[12],具體操作如下:術前大鼠禁食12 h,3%異氟烷麻醉大鼠,手術過程電熱毯維持大鼠體溫,使得大鼠肛溫為(37.0±0.5) ℃,保持室溫25 ℃。備皮消毒后,縱向切開頸部皮膚,分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈,結扎頸內動脈遠心端,夾閉頸總動脈和頸內動脈,在頸外動脈近心端剪口,沿著頸外動脈向頸內動脈插入線栓,有輕微阻力感時停止,深約1.8～2.0 cm。結扎血管固定好線栓,皮膚縫合并消毒。假手術組不做插線栓處理。術后以Longa評分法[13]對大鼠進行初步神經行為學評分,具體評分原則見表1,評分為1分和2分的造模大鼠視為模型建立成功,納入后續實驗。造模3 h后,各組大鼠尾靜脈注射給予相應藥物,假手術組和模型組給予同體積生理鹽水,每日1次,連續3 d,末次給藥2 h后取材。

表1 Longa評分細則

2.2 神經功能缺損評分在造模72 h后,通過改良大鼠神經嚴重程度評分法(modified neurological severity score,mNSS)對大鼠運動、感覺、反射和平衡功能進行評估[14]。運動測試、平衡木測試及發射測試具體評分方法見表2;感覺測試包括放置實驗和本體感覺實驗,各計1分;發射測試包括耳廓反射、角膜反射、驚恐反射,各計1分;異常運動涉及癲癇、肌陣攣后肌張力障礙,計1分。各項評分加和為mNSS 評價得分,總分18分。

表2 mNSS評分表

2.3 TTC染色末次給藥2 h后,每組取5只大鼠異氟烷麻醉后處死。取大鼠大腦去除小腦、腦干和嗅球后置于腦槽中連續切厚度為2 mm的冠狀切片。腦組織切片按照順序置于2% TTC溶液中 37 ℃ 避光孵育10 min。根據染色情況評估腦梗死體積。用Image J圖像分析軟件分析各組腦梗死體積,公式如下:腦梗死體積=(6張腦片缺血對側面積之和-6張腦片缺血側未梗死面積)×2 mm/(6張腦片缺血對側總面積×2 mm×100%)。

2.4 HE染色及Nissl染色異氟烷麻醉大鼠后,對大鼠進行心臟灌流生理鹽水,取出的腦組織在體積分數4%多聚甲醛溶液中固定,經脫水、石蠟包埋及切片處理后,進行后續染色處理。染色前將石蠟切片分別于二甲苯、無水乙醇、體積分數95%乙醇、體積分數80%乙醇、體積分數70%乙醇、超純水中浸泡脫蠟。HE染色:用蘇木素染液浸泡切片 5 min,流水清洗,鹽酸乙醇分化液分化30 s后,自來水浸泡15 min。滴加伊紅染液染色1 min,流水清洗。Nissl染色:切片滴加焦油紫染色液,并置于 56 ℃ 恒溫箱1 h。超純水沖洗5 min;尼氏染色分化液分化30 s,顯微鏡下觀察至背景接近于無色為止。染色結束后,采用梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察拍片。

2.5 氧化應激指標檢測大鼠末次給藥2 h后,異氟烷麻醉大鼠,打開腹腔,用含抗凝劑的采血管通過腹主動脈取血。血液室溫靜置30 min后,4 ℃,3 000 r·min-1離心10 min,收集上清,即得到血漿,于-80 ℃冰箱保存。取各組大鼠血漿參照MAD和SOD檢測試劑盒說明進行檢測,用酶標儀檢測吸光度,計算各樣品MDA、SOD水平。MDA檢測:取200 μL待測血漿加入離心管中,按順序分別加入試劑一、試劑二、試劑三各200 μL,保鮮膜封口,95 ℃ 水浴加熱40 min。流水冷卻,4 000 r·min-1離心10 min。取上清,于532 nm波長檢測吸光度。標準品管和空白管分別用10 nmol·mL-1標準品和無水乙醇代替血漿樣品進行檢測。MDA含量(μmol·L-1)=(樣品吸光度-空白吸光度)/(標準品吸光度-空白吸光度)×標準品濃度。SOD檢測:將50 μL待測血漿加入含1 mL試劑一的離心管中,分別加入試劑二、試劑三、試劑四各100 μL,渦旋混勻,37 ℃恒溫水浴40 min。加入2 mL顯色劑,室溫放置10 min,于550 nm波長檢測吸光度。對照管用50 μL蒸餾水代替血漿樣品進行檢測。

SOD活力=(對照吸光度-樣品吸光度)/對照吸光度÷50%×反應體系稀釋倍數

2.6 TUNEL染色石蠟切片用含0.5% Triton的PBS溶液室溫孵育30 min;放入裝有煮沸的 0.01 mol·L-1檸檬酸鈉抗原修復液(pH 6.0)高壓鍋里進行抗原修復;滴加正常山羊血清工作液室溫封閉1 h,PBS溶液漂洗3次;室溫避光滴加DAPI孵育10 min,PBS溶液漂洗3次;避光條件下,每個組織切片滴加100 μL TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min,PBS洗滌3次。抗熒光淬滅封片劑封片,在倒置熒光顯微鏡下觀察缺血半暗帶TUNEL陽性細胞,于倒置熒光顯微鏡下觀察缺血半暗帶細胞凋亡情況。

細胞凋亡率=凋亡細胞數量/總細胞數量×100%

2.7 Western blot實驗用含10%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液超聲破碎提取大鼠腦組織蛋白,12 000×g離心10 min取上清液。BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,100 ℃沸水浴加熱10 min使蛋白變性。用4%～12% SDS-PAGE進行電泳,170 V 電泳40 min;然后轉移到PVDF膜上,PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h,并用TBST緩沖液洗滌3次,滴加稀釋好的一抗(稀釋比例為1：1 000),4 ℃孵育過夜。用與HRP結合的二抗(稀釋比例為1：10 000)孵育1 h,顯影。使用Image J軟件分析目的蛋白灰度值。

3 結果

3.1 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠神經功能障礙的影響與假手術組比較,模型組大鼠的mNSS評分明顯升高(P<0.01);與模型組比較,羥基紅花黃色素A低、中、高劑量組大鼠的mNSS神經功能評分顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注:與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖1 各組大鼠mNSS神經功能評分

3.2 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠腦梗死體積的影響與假手術組比較,模型組可見明顯梗死灶,腦梗死體積顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,羥基紅花黃色素A中、高劑量組腦梗死體積顯著減少(P<0.05)。見圖2。

注:與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05。圖2 各組大鼠腦組織TTC染色及梗死體積比較

3.3 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠腦組織形態學的影響HE結果顯示,假手術組大腦皮層組織細胞結構清晰,染色均勻,細胞間隙致密;模型組細胞結構破壞,排列不整齊,細胞核皺縮,細胞間隙疏松,可見明顯空洞;與模型組比較,羥基紅花黃色素A各組腦組織病理損傷均有所減輕。Nissl染色結果可見,假手術組神經元形態正常,排列規整,尼氏體數目豐富,著色均勻;模型組尼氏體著色較淺,神經元形態異常,細胞核皺縮,呈空泡樣變化,排列紊亂,核膜模糊不清;與模型組比較,羥基紅花黃色素A各組腦組織神經元形態明顯好轉,染色較均勻。見圖3。

圖3 各組大鼠HE染色及Nissl染色(比例尺:50 μm)

3.4 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠血漿中氧化因子MDA和SOD的影響MDA檢測顯示:與假手術比較,模型組大鼠血漿中MDA水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,羥基紅花黃色素A各組大鼠血漿MDA水平顯著降低(P<0.01),如圖4A。SOD檢測顯示:與假手術組比較,模型組大鼠血漿中SOD水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,羥基紅花黃色素A中、高劑量組大鼠血漿中SOD水平顯著升高(P<0.01),如圖4B;表明羥基紅花黃色素A可通過提高抗氧化酶SOD的表達并降低脂質過氧化物MDA含量發揮抗氧化作用。

注:A:各組MDA水平比較;B:各組SOD水平比較;與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。圖4 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠血漿中氧應激相關因子表達的影響

3.5 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠神經細胞凋亡率的影響TUNEL染色結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠缺血側大腦皮層TUNEL陽性細胞顯著增加(P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠缺血側皮層TUNEL陽性細胞顯著減少(P<0.01)。見圖5。

注:A:各組Tunel染色代表性圖像;B:各組Tunel陽性細胞量化結果;與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;n=3。圖5 各組大鼠缺血半暗帶細胞凋亡率(比例尺:100 μm)

3.6 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白的影響與假手術組比較,模型組大鼠腦組織缺血半暗帶Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),Bcl-2/Bax水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,羥基紅花黃色素A中、高劑量組可顯著下調Bax蛋白表達水平(P<0.05);羥基紅花黃色素A低、中劑量組可顯著上調 Bcl-2 蛋白表達(P<0.05);羥基紅花黃色素A低、中、高劑量組顯著升高Bcl-2/Bax水平(P<0.05)。見圖6。

注:A:Bax、Bcl-2蛋白表達條帶圖;B:Bax蛋白表達定量比較;C:Bcl-2蛋白表達定量比較;D:Bcl-2/Bax相對蛋白表達定量比較;與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01。圖6 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax 蛋白表達情況

3.7 羥基紅花黃色素A對pMCAO大鼠腦組織XIAP、Caspase-3蛋白的影響與假手術組比較,模型組大鼠腦組織缺血半暗帶XIAP蛋白表達顯著降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,羥基紅花黃色素A中劑量組可顯著上調XIAP蛋白表達(P<0.01);羥基紅花黃色素A低、中劑量組可顯著下調Caspase-3蛋白表達(P<0.05)。見圖7。

注:A:XIAP和Caspase-3蛋白表達條帶圖;B:XIAP蛋白表達定量比較;C:Caspase-3蛋白表達比較;與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。圖7 各組大鼠腦組織XIAP和Caspase-3蛋白表達情況

4 討論

缺血性腦卒中是最常見的卒中類型。中醫認為,痰瘀互結是卒中發病的關鍵病機,血瘀是主要病因和病理產物,瘀阻腦絡則是缺血性中風的病理核心,因此活血化瘀藥在腦卒中治療中被廣泛應用[15-16]。中藥常見活血化瘀藥紅花的主要有效成分羥基紅花黃色素A具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡,保護神經元,改善血管功能等作用,在治療心腦血管疾病方面表現出巨大的潛力[17-20]。過多的氧化物產生會改變細胞膜通透性,破壞血腦屏障結構和功能。研究表明,羥基紅花黃色素A可通過抑制氧化應激調節線粒體功能,改善缺氧/復氧造成的細胞損傷[21]。本研究顯示,pMCAO大鼠給藥羥基紅花黃色素A后血漿中SOD升高、MDA降低,減少缺血引起的細胞凋亡。

長時間的缺血缺氧導致的細胞發生不可逆死亡是缺血性腦卒中致殘、致死率高的直接原因[22]。在缺血核心區引發的壞死和半暗帶因低灌注和能量代謝障礙導致的凋亡是缺血性腦卒中中最常見的細胞死亡方式。由于核心區細胞死亡的不可逆性,為限制梗死體積進一步擴大,半暗帶細胞凋亡的調節可作為缺血性中風發生后主要的治療方向[23]。XIAP是細胞凋亡的重要調節因子,參與壞死性凋亡等多種細胞死亡途徑的調節。Bcl-2家族和Caspase家族是線粒體介導的內源性細胞凋亡機制中的重要組成部分。細胞凋亡過程中,抗凋亡蛋白Bcl-2被抑制,促凋亡蛋白Bax被激活,導致線粒體外膜透化,線粒體釋放細胞色素C和半胱氨酸蛋白酶激動劑(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)引發Caspase級聯反應[15]。XIAP通過抑制凋亡效應子Caspase-3發揮抗凋亡作用,同時XIAP也受Smac負調節,可解除對Caspase-3的抑制作用,進而促進凋亡[25]。由于XIAP的結構具有E3泛素化酶活性,可參與NF-κB、MAPK/JNK、Wnt/β-catenin等多條信號通路的調節[26]。Zhou等[27]研究發現XIAP 可通過介導NF-κB活化,減少缺血所致的氧化應激損傷,抑制細胞凋亡。近幾年研究表明,XIAP在MCAO大鼠模型中表達降低[28];通過上調XIAP可減少miR-186-5p對OGD誘導的神經細胞凋亡[29];長鏈非編碼RNA Peg13通過上調XIAP 可減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷所致的海馬神經元凋亡[30]。本研究顯示,羥基紅花黃色素A給藥后,pMCAO大鼠Caspase-3表達降低,Bcl-2/Bax相對蛋白表達升高,XIAP表達升高,提示羥基紅花黃色素A通過抗細胞凋亡發揮腦保護作用的機制可能與調節XIAP表達有關。

綜上所述,羥基紅花黃色素A可改善腦缺血所致的神經功能缺損,減少腦梗死面積,其機制可能與提高XIAP的表達,抑制Caspase-3表達,促進Bcl-2/Bax相對蛋白表達,從而抑制線粒體介導的內源性凋亡途徑,同時抑制過氧化物產生,減少缺血導致的氧化應激損傷,抑制細胞凋亡有關。本研究以XIAP為靶點探討羥基紅花黃色素A對腦缺血后細胞凋亡的影響,以期為進一步研究羥基紅花黃色素A治療腦卒中的作用機制提供理論和實驗基礎。