CXCL2在結直腸癌中的表達及臨床意義

陸娜娜 白真真

結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤,并且在我國結直腸癌的中位發病年齡呈逐年遞減的趨勢[1]。早期結直腸癌患者術后5年生存率可達90%以上,在有長期篩查計劃的國家,結直腸癌死亡率下降幅度最大[2]。因此,尋找更敏感、更特異的結直腸癌分子靶點已迫在眉睫。CXCL2也稱為生長相關基因產物(GROβ),是趨化因子家族(CXCLs)的一員,在炎癥損傷修復過程中起著非常重要的作用,例如參與細胞骨架的重組、細胞遷移、粘附和免疫反應[3]。目前關于CXCL2蛋白在結直腸癌中的表達以及意義研究較少,本研究旨在研究CXCL2的結直腸癌分子病理學特征,為結直腸癌臨床診斷治療等提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2021年12月60例在合肥市濱湖醫院接受結直腸癌根治手術治療患者的組織標本,對其臨床病理和生存預后資料進行收集。患者術前均未接受過放射治療或化學治療,每例患者取一對癌和癌旁樣本。60例患者中,男30例,女30例;中位年齡53歲;結直腸癌的病理分級根據WHO的分級標準進行評估,同時根據美國癌癥聯合委員會的標準進行TNM分期。本次研究符合合肥市濱湖醫院倫理學要求,所有納入研究的患者和家屬都已知情,并簽署書面協議。

1.2 方法 將石蠟包埋的組織切片(厚度4 μm)在二甲苯中脫蠟并以梯度濃度降低的乙醇重新水化。將切片置于3%濃度的過氧化氫中孵育30 min,以淬滅組織內源性過氧化物酶。將切片沒于檸檬酸鈉修復液中高壓修復5 min,以進行抗原修復。將切片在正常山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術有限公司)中于室溫孵育1 h,以封閉非特異性結合位點。然后去除多余封閉液,滴加以1∶100稀釋的CXCL2一抗工作液(A12639,武漢愛博泰克生物科技有限公司),并在4℃下孵育8 h,使用PBS作為陰性對照,陽性對照為隨一抗試劑贈送的已知陽性片。次日將切片在25℃下復溫1 h并洗滌后,滴加二抗工作液(丹科醫療器械技術服務有限公司),室溫孵育30 min后洗滌,最后使用DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行顯色,待一組切片有陽性反應出現后,將切片插入PBS中終止所有顯色反應。使用Mayer蘇木精進行復染,常規分化、返藍、脫水和透明后,中性樹膠封片。

1.3 結果評價 所有免疫組化結果由2位5年以上年資的病理科醫師在顯微鏡下進行評分,要求每個400倍視野至少有200個可用于評分標準的細胞,評分結果經聯合閱片后協商給出。評分標準:將陽性強度按照無色算為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分;陽性細胞數<5%為0分,5%～25%為1分,25%～50%為2分,50～75%為3分,>75%為4分。然后將染色強度×陽性細胞百分比對應的值作為評分。0～1為-,2～4為+,5～8為++,9～12為+++。以-和+認為表達陰性,以++和+++認為表達陽性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 23.0統計軟件,計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,采用Log-rank檢驗比較生存率之間的差異,采用Cox比例風險模型分析預后結果的單變量和多變量,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCL2在結直腸癌及癌旁組織中的表達 免疫組化結果顯示CXCL2蛋白在結直腸癌細胞中陽性部位主要定位于細胞核和細胞漿,鏡下觀察陽性表達表現為鮮黃色、棕黃色和黃褐色顆粒,染色強度明顯高于背景。CXCL2在結直腸癌組織中的表達陽性率為80%(48例),在正常結直腸組織表達陽性率僅為36.7%(22例),CXCL2在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常結直腸組織(P<0.01)。見圖1,表1。

表1 CXCL2在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達 n=60,例

圖1 CXCL2蛋白在結直腸癌組織中的表達(HE×400);A 結直腸癌組織中CXCL2呈強陽性(+++);B 結直腸癌組織中CXCL2呈中陽性(++);C 結直腸癌組織中CXCL2呈弱陽性(+);D 結直腸癌組織中CXCL2呈陰性(-)

2.2 結直腸組織中CXCL2蛋白的表達與患者病理參數的關系 將60例結直腸癌組織根據CXCL2蛋白免疫組化評分高低分為CXCL2高表達和CXCL2低表達,與CXCL2低表達比較,CXCL2高表達表現為更高的N分期(P=0.017)和M分期(P=0.035),均有顯著相關性;然而CXCL2高表達與結直腸癌患者年齡、性別、病理分級和T分期均無顯著相關性(P>0.05)。見表2。

表2 CXCL2表達與結直腸癌臨床病理參數的關系 例

2.3 高CXCL2水平預示結直腸癌患者預后不良 隨訪所有患者的預后數據,并分析CXCL2的表達與結直腸患者預后的關系。采用Log-rank法進行生存分析,結果顯示CXCL2高表達的患者OS時間比CXCL2低表達的患者(Hazard Raito=2.718,95% CI:1.067～6.921,Log-rankP=0.036)更短。同時,DFS生存曲線顯示,與CXCL2低表達的患者比較,CXCL2高表達的患者的DFS時間較短(Hazard Raito=2.612,95% CI:1.128～6.635,Log-rankP=0.045)。此外,單因素分析和多因素分析顯示,CXCL2表達水平是結直腸癌患者OS和DFS的獨立危險因素(P均<0.05)。見圖2,表3,4。

表3 影響結直腸癌患者OS和DFS的變量的單因素分析

表4 影響結直腸癌患者OS和DFS的變量的多因素分析

圖2 CXCL2表達與結直腸癌患者總生存期(左)和無病生存期(右)的相關性分析

3 討論

細胞趨化因子通過與細胞表面的受體結合在免疫應答過程中發揮重要作用[4]。CXC家族主要由內皮細胞、活化單核細胞、巨核細胞、成纖維細胞產生,多數成員參與中性粒細胞的趨化和激活,也可趨化B細胞和T細胞[5]。CXCL2又被稱為GRO-2、GROβ、MIP2-α等,最早發現于惡性黑色素瘤細胞表面,CXCL2與CXCR2受體結合主要參與體內炎性反應,趨化和激活各類炎性細胞到達目的部位,介導血管形成干細胞分化和神經遞質釋放修復創傷[6,7]。在肝癌中,甲基化引起CXCL2低表達從而促進肝細胞肝癌的發生[8]。在結腸癌中,CXCL2通過Gαi-2和Gαq/11介導以促進腫瘤發生,并有助于維持結腸癌細胞的干性特性[9]。除此之外,CXCL2還促進前列腺癌和口腔鱗狀細胞癌的骨破壞,在慢性淋巴細胞白血病進展中也發揮著重要作用[10-12]。因此CXCL2在惡性腫瘤發生和進展中發揮重要作用。

結直腸癌的發生發展是多基因表達調控失衡共同作用的結果[13],并且隨著人們對結直腸癌分子機制的研究,結直腸癌的生存率較從前已有很大提高,因此進一步尋找結直腸癌有關的關鍵分子至關重要。在本研究中,我們通過免疫組化技術檢測CXCL2蛋白在結直腸癌組織和正常組織中的表達水平,結果顯示在結直腸癌組織中,CXCL2蛋白表達水平顯著性上調,結直腸癌組織中CXCL2蛋白高表達與N分期和M分期有關,而與患者的年齡、性別、病理分級和T分期均無顯著相關性。提示CXCL2可能作為結直腸癌淋巴結轉移和遠處轉移的重要篩查指標,并且為結直腸癌靶向治療提供早期依據以及預后評估。此外,單因素分析和多因素分析顯示,CXCL2水平是結直腸癌患者OS和DFS的獨立危險因素。先前的研究已經證明了CXCL2在其他惡性腫瘤中的預后價值。我們通過Log-rank檢驗獲得的結果表明CXCL2高表達的結直腸癌患者比CXCL2低表達的患者具有更短的OS和DFS。此外,我們通過使用Cox比例風險模型得出結論,CXCL2是手術后結直腸癌患者的獨立預后因素。

綜上所述,我們首次發現CXCL2的表達在結直腸癌中上調,其高表達與結直腸癌患者的不良臨床特征以及不良OS和DFS差有關。CXCL2可能在結直腸癌的早期診斷和預后預測中起關鍵作用,因此CXCL2有望成為結直腸癌診斷和預后的潛在生物學標志物。