基于基因測(cè)序技術(shù)分析肛瘺患者微小RNA的表達(dá)特點(diǎn)及功能

蔡濤 李志 冷羽 張?zhí)┪?曹波 吳雪峰 景茂林 張琪琦 吳媛媛 王雪亮 李歡

肛瘺是肛門直腸部位的常見疾病,多為肛周膿腫發(fā)展的延續(xù)[1]。近年來隨著生活及飲食模式的變化,肛腸疾病的發(fā)病率持續(xù)上升,肛腸疾病發(fā)病率在成年人中達(dá)50.1%,我國肛瘺發(fā)病率占肛腸病的1.67%～3.60%[2,3]。microRNA(miRNA)是小的內(nèi)源性非編碼 RNA,已被證明可以影響許多重要的生物學(xué)過程,如細(xì)胞生長、組織分化、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和細(xì)胞凋亡。因此,miRNA 功能的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致人類發(fā)生疾病[4]。發(fā)現(xiàn)miRNA、確定其靶標(biāo)并進(jìn)一步推斷 miRNA 功能已成為了解 miRNA 的正常生物學(xué)過程及其在疾病發(fā)展中的作用的關(guān)鍵策略。多項(xiàng)研究表明,包括癌癥、心血管和代謝疾病在內(nèi)的無數(shù)生理過程和病理過程均高度依賴于miRNA[5]。然而,對(duì)于肛瘺的特征性miRNA及其相關(guān)通路的研究報(bào)道卻十分有限。RNA測(cè)序(RNA-Seq)是近年來發(fā)展較為成熟的高通量測(cè)序技術(shù),具有快捷分析、高分辨率等優(yōu)勢(shì)[6]。目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于肛瘺患者特征性表達(dá)miRNA的報(bào)道,既往有課題組通過基因檢測(cè)技術(shù)共得出13個(gè)差異表達(dá)的miRNA,但該研究存在樣本量較小等不足[7]。為得到更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果,本研究納入6例極具代表性的高位復(fù)雜性肛瘺患者,采用RNA-Seq技術(shù)篩選出在肛瘺組織中特異性表達(dá)的miRNA,進(jìn)一步豐富肛瘺患者特征性表達(dá)miRNA的數(shù)據(jù)庫,旨在為臨床中肛瘺的診斷及防治提供一定的證據(jù)及思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例均來源于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科2021年10月至2021年11月符合納入標(biāo)準(zhǔn)的高位復(fù)雜性肛瘺住院手術(shù)患者,本研究共計(jì)納入6例極具代表性的患者。所有患者簽署知情同意書,并通過醫(yī)院倫理審查。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2006 年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肛腸分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)結(jié)直腸肛門外科學(xué)組,中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)大腸肛門病專業(yè)委員會(huì)制定的《肛瘺臨床診治指南》高位復(fù)雜性肛瘺診斷;(2)經(jīng)歷≥2次肛瘺手術(shù)治療均未治愈;(3)年齡30～50 歲;(4)無糖尿病、高血壓、嚴(yán)重慢性肝腎功能不全等基礎(chǔ)疾病;(5)患者簽署知情同意書,并符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)精神障礙患者;(2)嚴(yán)重心肺及肝腎功能不全患者或孕婦。

1.3 方法 (1)分組及取材:將6例患者按照入院先后順序隨機(jī)分為3組,每組各2例,每例患者均取手術(shù)切除的瘺管組織標(biāo)本及瘺管遠(yuǎn)端正常組織標(biāo)本,形成自身配對(duì)對(duì)比。標(biāo)本采集后,采用PBS緩沖液反復(fù)沖洗血污,直至沖洗液接近無色,然后立即將組織置于凍存管液氮預(yù)處理,隨后放入干冰中保存轉(zhuǎn)運(yùn)。最終將3組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整合分析。(2)實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行,包括制備文庫和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。小RNA測(cè)序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)試劑盒。文庫制備工作完成后,對(duì)構(gòu)建好的文庫使用 Illumina Hiseq2500 進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序讀長為單端 1X50bp。

1.4 信息分析流程

1.4.1 miRNA差異表達(dá)分析:本研究采用浙江杭州聯(lián)川生物自主開發(fā)的ACGT101-miR(LC Sciences,Houston,Texas,USA)軟件,該軟件的分析流程如下:①去除3’接頭和垃圾序列:獲取clean data;②長度篩選:保留堿基長度在18-26nt的序列;③各種RNA數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析:將剩余序列比對(duì)(不包含miRNA)mRNA、RFam和Repbase數(shù)據(jù)庫,并進(jìn)行過濾;④miRNA鑒定:獲取有效數(shù)據(jù),并比對(duì)前體和基因組進(jìn)行miRNA鑒定;⑤采用T檢驗(yàn),進(jìn)行miRNA差異性分析。

1.4.2 差異性miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析:針對(duì)動(dòng)物物種,使用TargetScan、miRanda兩款軟件對(duì)顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。對(duì)兩款軟件預(yù)測(cè)出的靶基因分別按照每款軟件的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。TargetScan算法中去除context score percentile<50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max Energy)>-10的靶基因。最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。

1.4.3 富集分析:富集分析主要包括兩部分,一部分是GO功能注釋,一部分是KEGG Pathway功能注釋。首先把所有選定miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因?qū)?yīng)于每個(gè)功能或者每個(gè)通路注釋的gene數(shù)目統(tǒng)計(jì)出來,然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與所有選定miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因mRNA與注釋庫中的GO或者KEGG pathway對(duì)應(yīng)的gene數(shù)量(全部具備功能注釋的基因,或者全部具備功能注釋的miRNA靶基因)相比,計(jì)算得到P-value ≤ 0.05為閾值,滿足此條件的功能定義為miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)中顯著富集的功能。通過功能顯著性富集分析能確定miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)行使的主要生物學(xué)功能。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA表達(dá)水平分析 本研究共測(cè)得1116個(gè)差異表達(dá)的miRNA,共20個(gè)miRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中hsa-miR-432-3p、hsa-miR-181b-5p_R+1和hsa-miR-30d-3p表達(dá)水平具有明顯差異(P<0.01)。在表達(dá)水平升高的miRNA中,hsa-miR-2355-3p在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平是遠(yuǎn)端正常組織的7.07倍,hsa-miR-3910在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平是遠(yuǎn)端正常組織的3.01倍,bta-miR-2478_L-1_1ss2TA在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平是遠(yuǎn)端正常組織的2.99倍;在表達(dá)水平降低的miRNA中,hsa-miR-1277-3p在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平僅占遠(yuǎn)端正常組織的8%,hsa-miR-616-5p在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平僅占遠(yuǎn)端正常組織的10%,hsa-miR-223-5p_R+1在肛瘺瘺管壁組織中表達(dá)水平僅占遠(yuǎn)端正常組織的39%。見圖1～4,表1。

表1 差異表達(dá)的miRNA

圖1 20個(gè)差異表達(dá)miRNA的聚類分析圖

圖2 差異表達(dá)miRNA火山圖 圖3 差異表達(dá)miRNA韋恩圖 圖4 2組差異表達(dá)的miRNA

2.2 靶基因預(yù)測(cè)及富集分析結(jié)果

2.2.1 靶基因預(yù)測(cè):對(duì)差異表達(dá)的20個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)果顯示20個(gè)miRNA均預(yù)測(cè)到靶基因,共計(jì)預(yù)測(cè)到85510個(gè)靶基因。其中表達(dá)水平差異較顯著的hsa-miR-432-3p所預(yù)測(cè)到的評(píng)分較高的主要靶基因包括MSTN、ITGAV、YPEL5、LARS1、ASB15等,hsa-miR-181b-5p_R+1所預(yù)測(cè)到評(píng)分較高的主要靶基因包括YTHDC2、RPS6KB1、KLHL2、IL2、PRDM4等,hsa-miR-30d-3p所預(yù)測(cè)到評(píng)分較高的主要靶基因包括CCN3、DNAJC27、ZCCHC14、GLRA3、FSTL1等。

2.2.2 GO富集分析:結(jié)果顯示,每個(gè)基因參與的子條目分別是:生物功能、細(xì)胞組分、分子功能。本研究有差異表達(dá)的20個(gè)miRNA靶基因參與的生物過程包括:轉(zhuǎn)移酶活性、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、三磷酸腺苷結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合、細(xì)胞骨架、細(xì)胞投影、細(xì)胞連接、RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。細(xì)胞組分:細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞溶質(zhì)。分子功能:激酶。見圖5、6。

圖5 GO富集分析

圖6 GO富集分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

2.2.3 KEGG富集分析:通過KEGG富集分析顯示,與本研究中差異表達(dá)的20個(gè)miRNA密切相關(guān)的信號(hào)通路主要包括癌通路、癌癥中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、胰腺癌、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、長時(shí)程抑制、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)TRP通道、肝細(xì)胞癌、谷氨酸突觸、黏著斑、慢性粒細(xì)胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。見圖7。

圖7 KEGG富集分析

3 討論

肛瘺作為臨床的常見病、多發(fā)病,目前主要通過手術(shù)治療,然而由于肛門解剖位置的特殊性,常導(dǎo)致術(shù)后創(chuàng)面難愈且并發(fā)癥較多,是肛腸外科醫(yī)生所面臨的巨大難題。MicroRNAs(miRNAs)是大小為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA,作為一種新興的研究領(lǐng)域逐漸成為研究的熱點(diǎn)。20多年前,第一個(gè)微小RNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)開啟了分子生物學(xué)的新紀(jì)元。迄今為止,已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)了2000多種miRNA,它們可通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解,從而調(diào)控人類基因組中約三分之一的基因。一種miRNA 可以同時(shí)靶向位于同一細(xì)胞信號(hào)通路中的多個(gè)基因[8-10]。miRNA與許多人類疾病有關(guān),已被廣泛用作臨床診斷和治療的靶點(diǎn)。對(duì)于生物學(xué)家來說,定義 miRNA 的目標(biāo)集是理解其生物學(xué)作用的關(guān)鍵;而對(duì)于開發(fā) miRNA 療法的醫(yī)學(xué)學(xué)者而言,經(jīng)過驗(yàn)證的靶標(biāo)為確定 miRNA 模擬物或抑制劑的功效提供了最佳生物標(biāo)志物。因此,對(duì)疾病的特征性miRNA 及其靶基因、信號(hào)通路、生物功能等方面的研究顯得十分重要[11]。

miRNA 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在整個(gè)工作流程中占據(jù)核心位置,是揭示 miRNA 功能并將 miRNA 與其他 RNA(mRNA、lncRNA 和 circRNA)聯(lián)系起來的關(guān)鍵步驟。本研究采用基因測(cè)序技術(shù),共測(cè)得20個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征性miRNA。通過靶基因預(yù)測(cè),并進(jìn)一步GO及KEGG富集分析,結(jié)果顯示,本研究得到的差異表達(dá)的20個(gè)miRNA靶基因所參與的生物過程主要包括:轉(zhuǎn)移酶活性、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、三磷酸腺苷結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合、細(xì)胞骨架、細(xì)胞投影、細(xì)胞連接、RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞溶質(zhì),分子功能主要包括激酶。與本研究中差異表達(dá)的20個(gè)miRNA密切相關(guān)的信號(hào)通路主要包括癌通路、癌癥中的蛋白聚糖、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、胰腺癌、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、長時(shí)程抑制、炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)TRP通道、肝細(xì)胞癌、谷氨酸突觸、黏著斑、慢性粒細(xì)胞白血病以及Ras、Rap1、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo、ErBb、Calcium、Apelin等通路。

研究發(fā)現(xiàn)MAPK-RAS信號(hào)通路與細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡和遷移功能密切相關(guān),與癌癥的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切,被認(rèn)為是癌癥治療的潛在治療靶點(diǎn)[12]。此外,劉宏偉等[13,14]研究發(fā)現(xiàn),RAS通路在慢性難愈性創(chuàng)面中,對(duì)促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)和再生發(fā)揮重要調(diào)控作用。不僅如此,多項(xiàng)研究表明,增強(qiáng) RAS/RAF/ERK 信號(hào)通路的活性,可顯著促進(jìn)血管新生,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[15-21]。PI3K-Akt 信號(hào)通路涉及許多生物過程,包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管生成和葡萄糖代謝[22]。PI3K/Akt 通路是細(xì)胞增殖和凋亡必不可少的途徑,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[23]。已經(jīng)證實(shí)抑制PI3K/Akt可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PI3K抑制劑可能靶向腫瘤血管生成以增強(qiáng)癌癥治療,也可能是靶向傷口血管生成,促進(jìn)創(chuàng)面愈合的靶點(diǎn)。由上可知,RAS、MAPK、PI3K-Akt等通路的抑制也可能是肛瘺術(shù)后創(chuàng)面難愈的機(jī)制之一,上述通路也可能成為促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的治療靶點(diǎn)之一。近期研究發(fā)現(xiàn),Rap1可能會(huì)拮抗 Ras蛋白,要么通過競(jìng)爭(zhēng)共同目標(biāo),要么通過作為G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性生長信號(hào),對(duì)抗成纖維細(xì)胞中的Ras生長促進(jìn)信號(hào)[24]。因此,Rap1的過表達(dá),可能會(huì)延遲創(chuàng)面的愈合。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的第二信使,在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用,并調(diào)節(jié)許多生理和病理過程。cAMP 可以調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,主要通過蛋白激酶 A(PKA)及其下游效應(yīng)子如 cAMP 響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)。此外,PKA 可以磷酸化多種激酶,如 Raf、GSK3 和 FAK。異常的 cAMP-PKA 信號(hào)傳導(dǎo)涉及各種類型的人類腫瘤。cAMP-PKA 信號(hào)可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和代謝[25],值得注意的是,cAMP 信號(hào)既可能具有腫瘤抑制作用,又可能具有腫瘤促進(jìn)作用,具體取決于腫瘤類型和背景。cAMP主要通過PKA、Epac1 和 Epac2調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞過程,包括遷移和黏著斑形成、心輸出量、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胞吐作用、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞存活[26]。Hippo通路是一種進(jìn)化上保守的信號(hào)通路,在器官發(fā)育、上皮穩(wěn)態(tài)、組織再生、傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[27]。YAP/TAZ是Hippo通路的成員之一,YAP/TAZ在基底層干細(xì)胞控制中的作用在表皮發(fā)育和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中都很明顯。在皮膚基底層觀察到核YAP和TAZ定位,表達(dá)水平在傷口愈合時(shí)明顯升高。實(shí)驗(yàn)證明,成年小鼠特異性敲除Yap1和Wwtr1后,皮膚組織損傷后的再生受到嚴(yán)重影響[28,29],提示YAP/TAZ活性在皮膚穩(wěn)態(tài)中是必不可少的,因?yàn)閅ap1/SWwtr1缺失使基底層細(xì)胞增殖減慢,導(dǎo)致組織損傷[30]。

然而,本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果也存在一定差異,裘建明等[7]通過檢測(cè)對(duì)比肛瘺并發(fā)混合痔的患者與單純混合痔患者手術(shù)切除的痔核近端肛管粘膜標(biāo)本,共得出13個(gè)差異表達(dá)的miRNA,兩項(xiàng)研究結(jié)果有且僅有一個(gè)miRNA相同,即hsa-miR-181a-2-3p。考慮出現(xiàn)此差異的原因主要與兩個(gè)研究所采用的標(biāo)本及檢測(cè)技術(shù)不同相關(guān)。目前諸多檢測(cè)分析所得出的miRNA結(jié)果存在較大的差異,也是限制miRNA進(jìn)一步研究的重要因素。

綜上所述,通過對(duì)肛瘺瘺管壁組織中特征性表達(dá)miRNA的檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)大量與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的信號(hào)通路,提示Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路的抑制,可能是肛瘺術(shù)后創(chuàng)面難愈的原因之一,這也與肛瘺術(shù)后創(chuàng)面屬于慢性難愈性創(chuàng)面的特點(diǎn)不謀而合。同時(shí),Ras、PI3K-Akt、cAMP、MAPK、Hippo等通路也可能成為促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的潛在靶點(diǎn),對(duì)于肛瘺的診治具有一定的指導(dǎo)意義。