色桿菌滅活疫苗的制備與免疫效果評價

林琳 劉蓓 徐素慧 周倫江 王隆柏 羅偉銘 何曉聰 陳云欽 黃杭 修云芳

摘 要：為防控小熊貓色桿菌病，按細菌滅活疫苗制備程序將海峽（福州）大熊貓研究交流中心2008年、2020年分離的2株色桿菌CV08毒株和CV20毒株經條件優化后滅活，分別制備成滅活菌液與鋁膠佐劑聯用制備成滅活疫苗。以BALB/c小鼠為試驗動物，建立色桿菌感染模型，用2種方式接種CV20毒株滅活疫苗，比較2種接種途徑效果。進一步設計2株色桿菌半數致死量（LD50）梯度對二免后小鼠進行攻毒保護試驗，同時進行交叉攻毒保護試驗。結果表明：CV20毒株滅活疫苗肌肉注射效果優于皮下注射。CV08毒株和CV20毒株對每只小鼠的LD50分別為3.2×108、5×107CFU。色桿菌CV08毒株滅活疫苗對不同LD50攻毒小鼠的保護率為83%、 70% 、60% ；色桿菌CV20毒株滅活疫苗對不同LD50攻毒小鼠的保護率為75% 、70% 、10%。試驗制備的CV08、CV20毒株疫苗含菌量均為4×109 CFU·mL-1，安全檢驗合格，能對自身菌株感染產生較好的保護效果但無交叉保護效果。

關鍵詞：小熊貓；色桿菌；滅活疫苗；免疫保護

中圖分類號：S 859.93? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0051-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.009

Abstract： In order to prevent and control the Chromobacterium infection in red pandas， according to the preparation procedure of bacterial inactivated vaccine， two strains of Chromobacterium CV08 strain and CV20 virulent strain isolated from Straits （Fuzhou） Giant Panda Research and Exchange Center in 2008 and 2020 were inactivated after the optimization of conditions， and then the inactivated bacteria solution was prepared by combining with the aluminumcontaining adjuvants to produce the inactivated vaccine. The BALB/c mice were used as the experimental animals to establish a model of Chromobacterium infection. The inactivated vaccine of CV20 virulent strain was inoculated in two ways to compare the effects of the two inoculation routes. The median lethal dose （LD50） gradient of two strains of Chromobacterium was further designed to carry out the challenge protection test on mice after the secondary immunization， and the crosschallenge protection test was also carried out. The results showed that the effect of intramuscular injection with the inactivated vaccine of CV20 virulent strain was better than that of subcutaneous injection. The LD50 of CV08 virulent strain and CV20 virulent strain to each mouse was 3.2×108 and 5×107 CFU，?respectively. The protective rates of the inactivated vaccine of Chromobacterium CV08 virulent strain on the mice challenged with different LD50 were 83%， 70% and 60%， respectively， while the protective rates of the inactivated vaccine of Chromobacterium CV20 virulent strain on the mice challenged with different LD50 were 75%， 70% and 10%， respectively. The bacterial contents of CV08 and CV20 virulent strain vaccines prepared in the experiment were both 4×109 CFU·mL-1， which passed the safety test and could produce better protective effect against the infection of their own strains but had no crossprotective effect.

Key words： Red panda； Chromobacterium； Inactivated vaccine； Immune protection

色桿菌屬是一類革蘭氏陰性，嚴格好氧或兼性厭氧菌，色桿菌屬命名非常混亂，文獻歸納色桿菌屬共有14個成員[1]，已確定的2個種為紫色色桿菌與藍黑色桿菌[2]。其中紫色色桿菌在小熊貓種群中流行主要以發熱、食欲不振、呼吸困難為主要臨床癥狀，致病性強、發病迅速、病死率高[3]。紫色色桿菌鮮有感染人，但感染后病程發展極為迅速，死亡率高，其發病機制尚不清楚，但大多數病人有被土壤或積水污染創傷或傷口的病歷[4]。2008年7月，海峽（福州）大熊貓研究交流中心發現3只小熊貓感染色桿菌，病死率為100%。2020年，該中心6只小熊貓陸續感染色桿菌，病程發展很快，發現癥狀2～5 d死亡。2021年南京紫清湖野生動物世界發生6例色桿菌感染小熊貓病例，其中死亡5例，病死率達到83.3%[5]，廣州也有發現小熊貓感染色桿菌病例（內部交流資料）。關于色桿菌感染小熊貓的研究多為臨床調查、疾病診斷、治療等[3，5-8]。考慮到該病對于小熊貓的傳染性和高病死率，若防治工作未做到位，該病可能會對圈養小熊貓種群造成毀滅性打擊。保護易感動物是動物傳染病防治要素之一，而接種有效疫苗是保護易感動物的重要手段。目前我國尚無針對小熊貓色桿菌的疫苗研究，本研究為小熊貓色桿菌的免疫接種研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及小鼠

色桿菌為海峽（福州）大熊貓研究交流中心2008年、2020年從死亡小熊貓體內分離，純化后用甘油保存法凍存于-70℃冰箱。

試驗小鼠為6周雌性SPF級BALB/c小鼠（吳氏試驗動物有限公司），體重均為20 g左右。

1.2 主要試劑

2%鋁膠佐劑（法國InvivoGen公司）、40%甲醛溶液（西隴科學股份有限公司）、無菌PBS（BL550A，北京蘭杰柯科技有限公司）、血瓊脂平板（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.3 試驗設計

1.3.1 小鼠致病性試驗 將保存的CV08、CV20菌種分別用血瓊脂平板復蘇，37℃培養24 h，之后刮平板菌落制菌液，4000 r·min-1，離心10 min，棄上清，用無菌PBS洗滌3次后加無菌PBS重懸。倍比稀釋法進行活菌計數，確定攻毒劑量。取50只小鼠每組5只，2株菌液攻毒濃度均分為1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU·mL-1 5個梯度。腹腔注射攻毒每只小鼠0.1 mL，觀察14 d，統計各組小鼠的發病和死亡情況。參考改良寇氏（Korbor）法測定2株菌的半數致死量[9]。其計算公式為：

lgLD50＝Xk－d（Pi－0.5）

式中Xk為最大對數劑量，d為相鄰組對數劑量差值，i為分組號，Pi為死亡率。

1.3.2 優化滅活條件和疫苗制備及安全性檢測

（1）優化滅活條件。按1.3.1中論述的方法配置2種菌液，分別加入濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%，然后置于4℃、37℃兩種溫度下培養。在6、12、24、36和48 h取100 μL滅活液涂布于血瓊脂平板上37℃培養48 h，觀察結果。無菌落表明細菌滅活完全徹底。觀察各種條件下平板菌落生長情況，選擇所用濃度最小、滅活時間最短條件為最佳。

（2）疫苗制備。將最佳滅活條件滅活后的細菌液4000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集菌體沉積。用無菌PBS洗滌3次除去甲醛和培養基，最后用無菌PBS重懸。洗滌后的細菌滅活菌（4×109 CFU·mL-1）：鋁膠佐劑=4∶1（V/V）的比例通過魯爾接頭與注射器充分混勻。疫苗4℃保存。

（3）疫苗安全性檢測。將所制備的疫苗搖勻后，接種100 μL于血瓊脂平板培養48 h觀察有無雜菌生長。結合佐劑說明書確定免疫劑量，皮下注射100 μL、小腿肌肉注射50 μL。使用2倍免疫劑量用兩種接種方式各注射2只小鼠，觀察記錄小鼠有無不良反應。

1.3.3 選擇最優接種方式 取40只小鼠，每組10只，分為H20組、M20組、對照（皮下）組、對照（肌肉）組。H20組背部皮下注射（100 μL），M20組小腿肌肉注射（50 μL）接種CV20毒株滅活疫苗，對照（皮下）組、對照（肌肉）組分別接種等量無菌PBS。參考文獻確定免疫時間[10-11]，第14 d后進行二免，二免疫后21 d對4組小鼠腹腔注射5LD50 CV20活菌液，攻毒后觀察14 d，觀察記錄小鼠死亡情況，計算免疫保護率（RPS），RPS=（1-免疫組死亡率/對照組死亡率）×100%[12]。

1.3.4 免疫小鼠攻毒保護試驗 選取120只小鼠，分為12組，每組10只。采用小腿肌肉注射接種CV20毒株滅活疫苗，1、2、3組接種CV08毒株滅活疫苗，4、5、6組接種CV20毒株滅活疫苗，剩余6組為對照組接種等量無菌PBS。二免后21 d對免疫小鼠進行攻毒保護試驗。1、2、3組攻毒CV08劑量分別為2LD50、4LD50、6LD50，7、8、9對照組攻毒CV08劑量分別為2LD50、4LD50、6LD50；4、5、6組攻毒CV20劑量分別為2LD50、4 LD50、6 D50，10、11、12對照組攻毒CV20毒株劑量分別為2LD50、4 LD50、6 LD50。攻毒后觀察14 d，觀察并記錄小鼠死亡情況。從而計算免疫保護率。

1.3.5 免疫小鼠交叉攻毒保護試驗 選取40只小鼠，分為4組，每組各10只，采用小腿肌肉注射免疫，1組接種CV08毒株滅活疫苗，2組接種CV20毒株滅活疫苗，3、4組為對照組等量注射無菌PBS。二免后21 d攻毒，對1、3組分別腹腔注射3LD50的CV20，2、4組分別腹腔注射3LD50的CV08。攻毒后觀察14 d，觀察并記錄小鼠死亡情況。從而計算免疫保護率。

2 結果與分析

2.1 小鼠致病性試驗結果

經過試驗數據結果計算CV08毒株和CV20毒株對每只小鼠的LD50分別為3.2×108、5×107 CFU。

2.2 優化滅活條件和疫苗安全性檢測

通過探究不同甲醛濃度、作用時間及溫度對2株色桿菌菌液的滅活效果，表明甲醛濃度越大、溫度越高，被完全滅活所需的時間越短。參考文獻[13-14]選出最佳滅活條件為甲醛濃度0.04%、滅活時間 24 h、溫度 37℃。試驗數據見表1、2。

滅活疫苗無菌檢驗未檢出任何活菌。肌肉注射小鼠注射部位無異常反應吸收良好，頸部皮下注射小鼠注射部位產生硬結，按壓疼痛，56 d未消散，4只小鼠注射疫苗后均無異常行為，10 d后小鼠均健活。上述結果說明本試驗疫苗安全。

2.3 確定最優接種方式

通過對比頸部皮下和小腿肌肉兩種免疫方式，CV20毒株滅活疫苗經肌肉免疫可避免頸部皮下注射吸收不良，使用滅活疫苗用量相對較少的同時保護效果也更顯著。CV20毒株滅活疫苗兩種接種方式保護率對比見表3。

2.4 免疫小鼠攻毒保護試驗

通過試驗數據說明相較于對照組，CV08毒株滅活疫苗能產生較好的保護作用，攻毒劑量2LD50、4LD50、6LD50的14 d內保護率分別為83%、70%、 60%。相較于對照組，CV20毒株滅活疫苗能產生較好的保護作用。攻毒劑量2LD50、4LD50、6LD50的14 d內保護率分別為75%、70%、10%。攻毒保護試驗結果見表4。

2.5 免疫小鼠交叉攻毒保護試驗

通過試驗數據說明2種菌株的滅活疫苗相互沒有交叉保護力。免疫小鼠交叉攻毒保護試驗結果見表5。

3 討論與結論

本試驗優化了2株色桿菌CV08毒株和CV20毒株的滅活條件。選擇鋁膠佐劑具有載體的作用，可緩慢釋放抗原，避免酶的降解，增加抗體效價[15]與滅活菌液連用制備滅活疫苗，以BALB/c小鼠為試驗動物建立感染模型。CV08、CV20毒株滅活疫苗在2LD50的攻毒劑量下對小鼠的保護率為83%與75%，均能對自身菌株感染產生較好的保護效果。本試驗為色桿菌滅活疫苗的深入研究提供技術參考。在CV20毒株滅活疫苗的攻毒保護試驗中，發現當攻毒劑量為6LD50時保護率僅為10%，與攻毒劑量為4LD50的保護率70%相比出現斷崖式的減少，可能與菌株毒力因子相關，還需進一步研究。2種滅活疫苗無交叉保護力的情況，可能因為2種菌株為不同菌種，CV08毒株為色桿菌新種。

本試驗通過CV20毒株滅活疫苗經頸部皮下和后腿肌肉2種不同的免疫途徑的比較，發現小腿肌肉注射的保護率高于頸部皮下注射，且使用疫苗劑量更小，副作用更小，基于此本次試驗采取后腿肌肉注射免疫。不同接種方式對血清抗體含量的影響需要建立檢測小鼠血清抗體的間接ELISA方法測定。由于課題時間限制本次試驗未建立間接ELISA方法，后期將完善建立間接ELISA方法，用于測定免疫小鼠血清內抗體含量，分析抗體消長規律以及不同接種方式對血清抗體含量的影響，有待進一步研究。

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（責任編輯：柯文輝）