生菜瞬時轉化條件優化

林杰鑫 張續業 嚴凌楠 許惠濱

摘 要：利用真空滲透法將改造過的包含綠色熒光蛋白（GFP）基因的pRHVnGFP載體轉入生菜組織中，研究生菜的瞬時轉化體系。通過對比不同的農桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103，在相同條件下的轉化效率，以及相同的農桿菌菌株在不同的侵染條件下的轉化效率，最終確定以農桿菌LBA4404侵染生菜，菌液濃度OD600為0.5，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態60 s（重復3次），作為侵染條件，可以獲得最高的轉化效率。

關鍵詞：綠色熒光蛋白；生菜；瞬時轉化體系；農桿菌；轉化效率

中圖分類號：S 636.2? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0040-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.007

Abstract： The modified pRHVnGFP vector containing the green fluorescent protein （GFP） gene was transformed into the lettuce tissue by using the vacuum infiltration method to study the transient transformation system of lettuce. By comparing the conversion efficiency of different Agrobacterium strains EHA105， LBA4404 and GV3103 under the same conditions， and the conversion efficiency of the same Agrobacterium strain under different infection conditions， the infection conditions were finally determined as follows： the lettuce was infected with Agrobacterium LBA4404， the concentration of bacterial suspension OD600 was 0.5， acetosyringone was not added， and the pressure state was maintained for 60 s （repeated 3 times） after vacuuming. Under these conditions， the highest conversion efficiency could be achieved.

Key words： Green fluorescent protein； Lettuce； Transient transformation system； Agrobacterium； Conversion efficiency

植物生物反應器是利用植物體或植物細胞表達外源基因，從而生產具有藥用價值或行使重要功能的蛋白質、抗體、多肽、脂類等的一種新型生物反應器[1]。相比于傳統的利用發酵罐作為生物反應器進行生產，將植物生物反應器打造成植物工廠來進行生產，具有成本低、周期短且不易感染動物源病毒的優點[2]。20世紀90年代以來，我國愈加重視植物生物反應器的研究，從“九五”計劃時選擇“利用轉基因植物生產口服疫苗和生物可降解塑料”等4個研究課題作為探索性項目予以資助，到“十二五”期間，國家863計劃在現代農業技術領域設置了“動植物生物反應器”主題項目對該領域進行持續支持[3]。現如今已利用植物生物反應器成功生產各種抗原蛋白[4]。而在國外，植物生物反應器更是研究熱門，2022年2月24日加拿大在全球范圍內首次批準了其本土研制的植物源新冠疫苗，引起了國內外研究者的轟動，再次證明了植物生物反應器前景廣闊[5]。

鑒于植物作為藥物蛋白質表達和生產系統的重要性，其相關研究已開展近30年，其中，多葉植物如煙草、擬南芥、生菜等，具有高生物量、可溶性蛋白含量高，生產過程無須經歷開花階段的特點使其在生產口服性疫苗方面適合作為反應器的宿主[6]。然而，即使植物生物反應器生產外源蛋白具有天然的生產優勢，仍需占有整個生產成本超80%的下游加工成本[7]。已報道在瞬時表達系統的應用中，目前利用煙草作為宿主表達外源蛋白的周期在7 d左右，但因為煙草本身的性質，其下游蛋白提純費用高且效率低；而生菜中含有與煙草相比更少的尼古丁等有毒化學物質，所以在生產外源蛋白并提純應用中生菜更加具有可行性[8]。本研究將以綠色熒光蛋白（GFP）基因作為報告基因，利用農桿菌滲透法對比不同農桿菌以及相同農桿菌不同侵染條件下生菜的瞬時轉化效率，進而優化生菜瞬時轉化條件，為后續生菜作為宿主在生物反應器中的應用奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 以生菜作為受體材料，生菜來自福建省農業科學院植物保護研究所福清基地。

1.1.2 菌種及質粒 大腸桿菌 DH5α，農桿菌EHA105、LBA4404和GV3103以及穩定表達載體pRHVnGFP 均由閩江學院地理與海洋學院海洋與農業生物技術實驗室保存。

1.2 試劑

限制性核酸內切酶Pst I和EcoR V，T4 DNA Ligase均購自上海TakaRa公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；農桿菌生長培養基LB、YEB（酵母提取物肉湯、5 g·L-1蔗糖、5 g·L-1胰蛋白胨、6 g·L-1酵母提取物、0.24 g·L-1 MgSO4，pH 7.2）以及滲透培養基（10 mol·L-1 MES，10 mol·L-1 MgSO4）均購自廈門泰京生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 載體構建 以穩定表達載體pRHVnGFP為基礎載體，利用限制性核酸內切酶Pst I和EcoR V對pRHVnGFP載體進行雙酶切，利用同源重組的方法，將Ubipro啟動子替換為35spro啟動子。同源重組引物為pRHVcGFP35SF （agatcccccgaattactgcagGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTG） 和pRHVcGFP35SR（atcccactggatctggatatcAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG）； 同源末端擴增引物為pRHVnGFP35sF （agatcccccgaattactgcagGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTG）和pRHVnGFP35sR（gcccttgctcaccatgatatcAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG）。在T4 DNA Ligase的作用下16℃連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，在添加50 mg·L-1卡那霉素的LB培養基上篩選，挑取單菌落進行菌液PCR檢測；提取質粒，用Pst I/EcoR V酶雙酶切對重組質粒進行酶切鑒定。將鑒定正確的陽性菌株送往生工生物工程（上海）有限公司測序以驗證啟動子是否正確。

1.3.2 農桿菌轉化 采用凍融法將重組質粒分別轉化至農桿菌EHA105、LBA4404和GV3103菌株，培養于含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的LB固體培養基上，并挑取單菌落進行PCR檢測。

1.3.3 不同農桿菌菌株轉化效率對比 分別挑取重組質粒轉化農桿菌EHA105、LBA4404和GV3103菌株的單克隆接種到0.5 L添加抗生素的YEB液體培養基（50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素）。將接種的培養物在搖床（220 r·min-1）中以28℃孵育48 h。通過添加YEB培養基測量OD600值并調節至3.5～4.5。然后收集培養液，離心（4500 r·min-1）10 min。將農桿菌細胞重懸在滲透培養基中培養至OD600為0.5。

將制備好的農桿菌培養懸浮液置于2 L燒杯，置于干燥器中。用刀將前10%的生菜切除，將其倒置（核心向上）并輕輕地旋轉于細菌懸浮液中，并干燥器密封。將真空泵（Welch Vacuum，Niles，IL，USA）打開以抽空，保持壓力狀態30～60 s。然后打開該系統以釋放壓力，使滲透液滲入組織內的空間。該過程重復2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中有明顯擴散。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續沖洗3次，轉移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4 d，利用 LUYOR3415RC手持熒光燈對eYGFP的表達量進行初步觀察分析并拍照記錄。

1.3.4 農桿菌侵染條件優化 在確定農桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103的轉化效率以后，以轉化效率最高的農桿菌菌株侵染生菜，優化農桿菌侵染條件，通過手持熒光燈對 eYGFP的表達量進行觀察分析并拍照記錄，最終確定最佳的農桿菌侵染條件。

2 結果與分析

2.1 GFP基因的瞬時表達載體構建

利用限制性核酸內切酶Pst I和EcoR V對質粒pRHVnGFP進行雙酶切，回收酶切產物，與經相同酶切后的35spro啟動子連接，將穩定表達載體pRHVnGFP（圖1）的啟動子Ubipro替換為35spro啟動子，成功構建1個GFP基因的瞬時表達載體（圖2）。

2.2 農桿菌轉化

利用35spro F/35spro R引物分別對轉化農桿菌EHA105、LBA4404和GV3103感受態細胞的載體質粒pRHVnGFP進行菌液PCR檢測（圖3），結果表明載體質粒已成功轉化3種農桿菌感受態細胞中，可用于后續生菜瞬時轉化。

2.3 不同農桿菌轉化效率的比較

由圖4可知，經激發光照射在已轉化的生菜葉片區域可觀察到eYGFP 綠色熒光信號（圖 4b～d中紅色箭頭所示），紅色為自發熒光。通過對比發現，在相同的菌液濃度、真空滲透壓和滲透時間條件下，不同的農桿菌菌株LBA4404、EHA105和GV3103的轉化效率不同，其中，經農桿菌LBA4404侵染后生菜葉片上檢測到的eYGFP 綠色熒光信號最強（圖4b），EHA105次之，GV3103最低。

2.4 農桿菌侵染條件優化

由圖5可知，優化農桿菌LBA 4404真空滲透體系，以OD600為0.5的農桿菌菌液，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態60 s（重復3次），作為侵染條件，這樣可以獲得較高的轉化效率（圖5b）。觀察經激發光照射在已轉化的生菜葉片區域的eYGFP 綠色熒光信號（紅色箭頭所示），結果發現大量的eYGFP 綠色熒光信號，紅色為自發熒光。而常規侵染條件下觀察到的eYGFP 綠色熒光信號則較弱（圖5a）。

3 結論與討論

植物生物反應器在表達系統的分類上可分為穩定表達系統和瞬時表達系統。穩定表達系統將外源基因導入植物細胞中并完成整合，使其在生長過程中穩定表達，周期長，且需要嚴格管理種植環境，但是對目標蛋白的表達穩定。瞬時表達系統則是在外源基因導入宿主細胞后獨立于宿主細胞基因組進行轉錄翻譯，完成外源蛋白的表達與積累，具有周期短、產量高和操作簡單的優勢[9]。植物生物反應器中兩種表達系統的目的都是完成對宿主細胞進行外源基因的導入，其中，穩定表達系統在完成表達載體的構建并進行穩定基因轉化之后，需在高要求條件下對轉化作物進行培育后才可收獲，成本高，周期長，對生產環境要求高易造成生物污染。而在瞬時表達系統中，可直接對已經培育好的對應農作物或其離體葉片或愈傷組織進行病毒感染或農桿菌浸染完成轉化，在幾小時或幾天內完成目的蛋白的生產和積累，該過程完全在密閉容器中進行，最大限度杜絕了生物安全問題，并且只要完成表達載體的建庫即可做到相關蛋白的隨時有需求隨時可生產，且通過菌種的篩選以及培養濃度、侵染環境和侵染時間的調控還可提高瞬時轉化的效率[10]。研究還表明優化轉化條件時針對外源基因表達選擇適合的啟動子和增強子也可促進宿主植物中外源基因的表達，提高外源產物的產量[11]。

生菜為菊科萵苣屬的一個變種，不需要加工即可在人體或動物體內的消化道中被有效吸收，且一年四季皆可收獲，培育條件簡單、生長周期短等特點奠定了其作為宿主在植物生物反應器中應用的巨大前景，其培育技術及遺傳轉化技術的成熟將大大降低其生產藥用蛋白的成本[12]。番茄、生菜和一些水果可生食，避免在加熱過程中使蛋白質變性的特點已被廣泛用于生產食用疫苗的研究和開發當中[13-14]。當含有外源藥用蛋白的生菜以食用的方式使用時，可以極大程度減輕患者的精神壓力和經濟壓力。目前生菜已經成為一種非常高效，可重復，廉價的瞬時表達系統，可成功表達乙型肝炎amiRNA，小鼠食用后肝損傷得到了明顯逆轉[15]。未來生菜還將用于生產單克隆抗體和其他具有重要藥用價值的蛋白質。

本研究以GFP基因為報告基因構建一個植物瞬時表達載體，并利用農桿菌真空滲透法轉化生菜構建生菜瞬時表達系統，通過對比不同的農桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103的轉化效率，發現LBA4404最適合，轉化效率最高。在此基礎上，不斷優化侵染條件，分別對比了3種農桿菌菌液濃度（OD600分別為0.2、0.5和0.8），添加和不添加乙酰丁香酮，以及不同的真空滲透壓和滲透時間等條件下GFP 蛋白的表達情況，最終確定以OD600為0.5的農桿菌LBA 4404，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態60 s（重復3次），作為侵染條件，可以獲得較高的轉化效率。完成生菜高效瞬時轉化體系條件優化，能夠以生菜作為生物反應器高效快速及時地表達外源蛋白，滿足生產需求。

參考文獻：

[1]楊晶，杜林娜，王法微，等.新型植物生物反應器研究進展[J].生物產業技術，2018（5）：104-109.

[2]王治，王躍駒.生物反應器植物工廠[J].生命世界，2019，360（10）：46-47.

[3]“十二五”863計劃現代農業技術領域“動植物生物反應器”主題項目各課題通過驗收[J].中國農業科技導報，2017，19（6）：139.

[4]楊賀.利用植物生物反應器生產藥用蛋白的研究[J].吉林農業，2016（21）：81.

[5]HUGUES F B， GARY K.Plantmade vaccines and therapeutics[J].Science，2021，373：740-741.

[6]HUEBBERS J W，BUYEL J F.On the verge of the marketPlant factories for the automated and standardized production of biopharmaceuticals[J].Biotechnology Advances，2021，46：107681.

[7]黨偉華，李佳，王愛萍.重組蛋白在植物中表達及純化的研究進展[C]//中國免疫學會.第十二屆全國免疫學學術大會摘要匯編，2017：1.

[8]王躍駒，李文.生菜作為宿主在表達蛋白和/或多肽中的應用.CN201710458311.6[P].2017-10-10.

[9]許惠濱，王福祥.植物生物反應器表達系統研究進展[J].福建農業科技，2021，52（9）：76-81.

[10]鄒奇，潘煒松，邱健，等.植物生物反應器優化策略與最新應用[J].中國生物工程雜志，2023，1-27.

[11]CAI Y M，KALLAM K，TIDD H，et al.Rational design of minimal synthetic promoters for plants[J].Nucleic acids research，2020，48（21）：11845-11856.

[12]羅雯，張同林，艾佐佐，等.意大利生菜轉化體系建立及EV71抗原基因表達初探[J].生命科學研究，2018，22（3）：208-214.

[13]錢虹妹.農桿菌介導的一種新型鮭魚降鈣素（msCT）轉化生菜的研究[D].南京：南京農業大學，2004.

[14]李靜.人干擾素β在生菜中的表達、鑒定和生物活性研究[D].泰安：山東農業大學，2007.

[15]ZHANG S，SANG X，HOU D，et al.Plantderived RNAi therapeutics：A strategic inhibitor of HBsAg[J].Biomaterials，2019，210：83-93.

（責任編輯：柯文輝）