藍(lán)莓3個(gè)ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子的克隆及其生物學(xué)功能

沈芷琦 朱林梢 余穎 陶歆鈺 周非 陳僑月

摘 要：藍(lán)莓Vaccinium spp.的生長(zhǎng)代謝極大程度受到金屬離子平衡的影響，ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在調(diào)節(jié)植物體金屬穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵性作用，但目前有關(guān)藍(lán)莓ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)研究較少。為探究藍(lán)莓ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)﹁F（Fe）、 鋅（Zn）、 鎘（Cd）等金屬離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，以北高叢藍(lán)莓布里吉塔為研究材料，對(duì)藍(lán)莓ZIP基因家族成員進(jìn)行克隆，采用生物信息學(xué)方法分析得到候選基因的核苷酸序列、氨基酸序列、跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)比其他植物的ZIP家族基因，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并篩選得到高相似性的重點(diǎn)研究對(duì)象；通過(guò)添加金屬水培藍(lán)莓的VcZIPs基因表達(dá)量分析，探究藍(lán)莓中ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子的生物學(xué)功能；通過(guò)轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析試驗(yàn)，驗(yàn)證VcZIPs異源表達(dá)時(shí)的功能。結(jié)果表明：克隆得到8個(gè)VcZIPs全長(zhǎng)cDNA序列，其中篩選出3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具有ZIP家族的典型二級(jí)結(jié)構(gòu)，或?yàn)闈撛诘腪IP家族成員。qRTPCR結(jié)果表明，藍(lán)莓葉部ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因轉(zhuǎn)錄水平普遍受到過(guò)量金屬離子的抑制；藍(lán)莓根部的VcZIPs基因表達(dá)普遍受根際過(guò)量金屬離子誘導(dǎo)，VcZIP4基因的表達(dá)量在缺Fe、過(guò)量Fe以及超量Cd處理組中分別上調(diào)為對(duì)照（CK）的5.3、86.5、和45.4倍，VcZIP7基因的表達(dá)量在過(guò)量Fe處理組中上調(diào)為對(duì)照的27.2倍，VcZIP 9基因的表達(dá)量在過(guò)量Cd、超量Cd條件下響應(yīng)最顯著，分別上調(diào)為對(duì)照（CK）的142.8倍和360.2倍。轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析試驗(yàn)表明，VcZIP7可能具有鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的功能；VcZIP4、VcZIP9均能介導(dǎo)錳的轉(zhuǎn)運(yùn)而VcZIP7不具備轉(zhuǎn)運(yùn)錳的能力；VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9均具有鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其中VcZIP7的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能最高，其相對(duì)較低的表達(dá)可能是藍(lán)莓鐵營(yíng)養(yǎng)低效的重要原因。研究結(jié)果可為揭示藍(lán)莓ZIP金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子家族的運(yùn)輸機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；克隆；生物學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S 663.9? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）03-0020-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.004

Abstract： The growth and metabolism of blueberry were greatly affected by the balance of metal ions. ZIP transporter protein family played a key role in regulating the metal homeostasis in plants. However， there were few studies on ZIP transporter protein in blueberry. In order to explore the absorption and transport mechanism of ZIP transporter protein gene in blueberry to the metal ions， such as ferric ion （Fe）， zinc （Zn）， cadmium （Cd）， the members of ZIP gene family in blueberry were cloned by using the northern highbush blueberry Brigitta as the research material. The nucleotide sequence， amino acid sequence and transmembrane domain of the candidate genes were obtained by using the bioinformatics method. Compared with the ZIP family genes of other plants， the phylogenetic tree was constructed and the key research objects with high similarity were screened. The biological function of ZIP transporters in blueberry was explored by analyzing the expression of VcZIPs gene in blueberry with metal hydroponics. The function of heterologous expression of VcZIPs was verified by carrying out the metal tolerance analysis test of transgenic yeast. The results showed that： eight fulllength cDNA sequences of VcZIPs were cloned， among which the three transporters， including VcZIP4， VcZIP7 and VcZIP9 had the typical secondary structure of the ZIP family or were the potential members of the ZIP family. The results of qRTPCR showed that the gene transcription level of ZIP transporter in the leaves of blueberry was generally inhibited by the excessive metal ions. The expression of VcZIPs genes in the roots of blueberry was generally induced by the excessive metal ions in rhizosphere. The expression level of VcZIP4 gene was upregulated by 5.3， 86.5， and 45.4 times compared with the control （CK） in the deficient Fe， excessive Fe and excessive Cd treatment groups， respectively. The expression level of VcZIP7 gene was upregulated by 27.2 times compared with the control in the excessive Fe treatment group. The expression level of VcZIP9 gene was the most significant under the conditions of excessive Fe and excessive Cd treatments， which was upregulated by 142.8 times and 360.2 times compared with the control （CK）， respectively. The metal tolerance analysis of transgenic yeast showed that， VcZIP7 might have the function of cadmium transport. Both VcZIP4 and VcZIP9 could mediate the transport of manganese， while VcZIP7?didn′t have the ability to transport manganese. VcZIP4， VcZIP7 and VcZIP9 all had the function of iron transport， among which VcZIP7 had the highest function of iron transport， and its relatively low expression might be an important reason for the low efficiency of iron nutrition of blueberry. The results could lay a foundation for revealing the transportation mechanism of the ZIP metal transporter family of blueberry.

Key words： Blueberry； ZIP transporter protein； Cloning； Biology

微量元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的成分，主要以離子的形式存在，參與多種生化反應(yīng)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程中至關(guān)重要[1]。缺乏或過(guò)量的礦質(zhì)元素，如鋅、鐵和銅，會(huì)對(duì)植物體內(nèi)的許多關(guān)鍵的生物化學(xué)反應(yīng)和代謝途徑產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[2]。過(guò)量攝入某些重金屬元素可能導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受阻、生理紊亂甚至死亡。因此，為確保植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的金屬元素平衡極為關(guān)鍵[3-5]。

植物中金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族種類(lèi)繁多，目前已得到鑒定的包括 ZIP（Znregulated，Ironregulated transporterlike Protein）家族、NRAMP（Natural Resistance And Macrophage Protein）家族、CDF（CationDiffusion Factor）家族等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)植物體內(nèi)金屬離子的吸收和運(yùn)輸，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程中承擔(dān)重要角色[6]。ZIP家族是植物中最先被分離出來(lái)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，定位在細(xì)胞膜上，其中兩個(gè)主要成員是ZRT（Zincregulated transporter）和IRT（Iron regulated transporter），參與調(diào)控Zn、Fe、Mn、Cu等金屬元素的吸收及Cd、Ni、Co等重金屬元素的轉(zhuǎn)運(yùn)。目前已克隆得到的ZIP家族成員主要在擬南芥[7]、水稻[8]、大麥[9]、玉米[10]等模式植物中，在擬南芥中克隆得到15個(gè)成員（AtIRT1～AtIRT3、AtZIP1～AtZIP12）；水稻中克隆得到18個(gè)成員（OsIRT1、OsIRT2、OsZIP1～OsZIP16）；大麥中克隆得到13個(gè)成員（HvIRT1、HvZIP1～HvZIP3、HvZIP5～HvZIP8、HvZIP10～HvZIP11、HvZIP13～HvZIP14、HvZIP16）；玉米中克隆得到9個(gè)成員（ZmIRT1、ZmZIP1～ZmZIP8）。現(xiàn)有研究表明，ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要承擔(dān)多種二價(jià)金屬陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+等[11]。同時(shí)，編碼ZIP蛋白的不同基因受環(huán)境金屬離子濃度的調(diào)節(jié)，在植物的地上部、根部及種子等部位的表達(dá)中呈現(xiàn)出差異性[12-16]。

在部分模式植物中，ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族已被證實(shí)能夠促進(jìn)Zn、Fe、Mn和Cu等金屬元素的吸收、運(yùn)輸和分隔，在調(diào)節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài)中起到至關(guān)重要的作用，而藍(lán)莓ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子家族的相關(guān)研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。藍(lán)莓在非酸性根際及有機(jī)質(zhì)匱乏的土壤里常出現(xiàn)葉片黃化、脈間失綠等典型缺Fe癥狀。因此栽培藍(lán)莓時(shí)常常采取降低土壤pH值的方法來(lái)增加土壤中有效Fe的濃度，從而提高藍(lán)莓對(duì)鐵的吸收和利用效率。然而，土壤酸度的上升會(huì)同時(shí)提高其他重金屬離子的可溶性，導(dǎo)致藍(lán)莓生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出生理性重金屬中毒，對(duì)藍(lán)莓的品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響[17-19]。因此，研究藍(lán)莓對(duì)Cd、Zn等重金屬毒害的耐受性及其相關(guān)機(jī)理具有重要的實(shí)踐意義。本研究從藍(lán)莓中克隆得到3個(gè)ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因cDNA，并利用qRTPCR和轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析試驗(yàn)，研究ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)模式及金屬轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以揭示藍(lán)莓對(duì)金屬元素的吸收利用機(jī)制，提升藍(lán)莓中礦質(zhì)元素的吸收效率并緩解重金屬的脅迫作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用長(zhǎng)勢(shì)相近的1年生北高叢藍(lán)莓布里吉塔（Brigitta），大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α，酵母表達(dá)載體pDR195，酵母材料包括：野生型DY1457（ade can1100oc his3 leu2 trp1 ura3），鋅鎘敏感型突變體△zrc1（MAT α；his△1；leu2△0；met15△0；YMR243：：kanMX4），錳吸收缺陷型突變體△smf1（SLY8;MAT α ura3 lys2 ade2 trp1 his3 leu2 smf1：：HIS3），鐵吸收缺陷型突變體DDY4（ura3 trp1 leu2 can1）。

1.2 儀器和試劑

儀器設(shè)備選用PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、恒溫振蕩器、-80℃超低溫冰箱、電子天平、pH計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)、顯微鏡、NanoDrop 2000分光光度計(jì)、熒光定量 PCR儀、人工氣候培養(yǎng)箱、氧氣泵等。

試劑選用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit試劑盒（TaKaRa，日本）、CTAB提取液、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液、SDURA培養(yǎng)基等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓總RNA提取及ZIP家族基因克隆 參照Vashisth等[20]和Tripti等[21]改良后的CTAB法提取藍(lán)莓葉、根系總RNA，利用檢測(cè)儀對(duì)樣本RNA濃度進(jìn)行檢測(cè)，并置于-80℃保存。采用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit試劑盒（TaKaRa，日本）合成得到cDNA的第一鏈，并置于-20℃溶液中保存。以實(shí)驗(yàn)室前期已知的VcIRT1特異序列為探針，對(duì)比藍(lán)莓的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，得到VcIRT1基因的同源序列，并采用ExPASy Translate tool軟件反向推導(dǎo)出氨基酸序列，通過(guò)NCBI的Blast功能篩選得出可能屬于ZIP金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的各組同源序列。采用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，以藍(lán)莓葉、根系總cDNA為模板，克隆得到目的基因片段，并將片段通過(guò)載體pMD19T Vector轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，用于驗(yàn)證目的基因片段的可靠性。

1.3.2 藍(lán)莓ZIP家族基因核苷酸序列、氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 采用ExPASy Translate tool軟件分析測(cè)序所得的候選ZIP家族基因的核苷酸序列，推導(dǎo)得知其氨基酸序列；采用TMHMM 2.0軟件分析候選ZIP金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子的跨膜結(jié)構(gòu)域；采用NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其他植物中已知的ZIP家族基因的氨基酸序列，通過(guò)MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行多序列比對(duì)分析。將候選ZIP金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子分析得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)與ZIP家族的典型二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，篩選得到高相似性的重點(diǎn)研究對(duì)象，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。

1.3.3 添加金屬離子水培對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)的影響 采用改良后的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培藍(lán)莓，參考藍(lán)莓水培中金屬離子過(guò)量的常用濃度，共設(shè)6個(gè)處理組，分別為對(duì)照（CK，含F(xiàn)e 40 μmol·L-1）；過(guò)量Fe（100 μmol·L-1）；缺Fe（0 μmol·L-1）；過(guò)量Zn（50 μmol·L-1）；過(guò)量Cd（5 μmol·L-1）；超量Cd（50 μmol·L-1）。每個(gè)處理組3次重復(fù)，每次重復(fù)為10 株藍(lán)莓苗。培養(yǎng)30 d后，觀察不同金屬處理組中藍(lán)莓苗的根、莖、葉生長(zhǎng)狀況。

1.3.4 添加金屬離子水培對(duì)藍(lán)莓3個(gè)ZIP家族基因表達(dá)量的影響 采用1.3.1方法提取水培處理后藍(lán)莓的葉、根系總RNA，并合成得到cDNA第一鏈，置于-20℃溶液中保存。利用Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物，使用ABI Prism 7000定量擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，對(duì)比不同處理組的藍(lán)莓葉、根中VcZIPs基因表達(dá)量的差異。采用 2-ΔΔCt法通過(guò)內(nèi)參基因 GAPDH對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)金屬Cd、Mn、Fe的耐性分析 （1）pDR195VcZIPs表達(dá)載體構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化 以載體pDR195為基礎(chǔ)，利用雙酶切-T4連接法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析試驗(yàn)表達(dá)載體，將VcZIPs分別連接至pDR195，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證目的片段的有效性。酵母轉(zhuǎn)化方法參照Gietz等[22]提出的醋酸鋰酵母轉(zhuǎn)化法，將pDR195VcZIPs重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入野生型DY1457、鋅鎘敏感型突變體△zrc1、錳吸收缺陷型突變體△smf1、鐵吸收缺陷型突變體DDY4中，用于驗(yàn)證候選基因在缺陷型酵母中是否起到金屬運(yùn)輸功能互補(bǔ)的作用。（2）轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析 依據(jù)不同突變體酵母的營(yíng)養(yǎng)需求，分別采用缺失相應(yīng)氨基酸的選擇性SDURA液體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的酵母單克隆，并置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度達(dá)到OD600=1.0。針對(duì)不同的缺陷型酵母的金屬吸收特性，在缺失相應(yīng)氨基酸的選擇性SDURA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行不同金屬處理，以觀察轉(zhuǎn)化后的酵母對(duì)金屬的耐性是否改變。（a）鋅鎘敏感型突變體△zrc1：選擇性SDURA固體培養(yǎng)基（CK）、添加50 μmol·L-1CdCl2的SDURA固體培養(yǎng)基；（b）錳吸收缺陷型突變體 smf1：選擇性SDURA固體培養(yǎng)基（CK）、添加20 μmol·L-1EGTA+15 mmol·L-1 MES的SDURA固體培養(yǎng)基；（c）鐵吸收缺陷型突變體DDY4：選擇性SDURA固體培養(yǎng)基（CK）、pH=5.6 SDURA固體培養(yǎng)基、5.8 SDURA固體培養(yǎng)基。

將OD600=1.0的酵母菌液以10倍梯度連續(xù)稀釋4次，獲得OD600=0.1、0.01、0.001、0.0001的梯度濃度菌液，分別點(diǎn)板至各處理組的SDURA固體培養(yǎng)基上。在30℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d后對(duì)比生長(zhǎng)狀況，并拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓ZIP家族基因生物信息學(xué)分析

8個(gè)ZIP基因編碼的多肽長(zhǎng)約350（337～397）個(gè)氨基酸。兩兩對(duì)比顯示，序列間存在較大差異，相似性低至19%（VcZIP2和VcZIP7），高達(dá)91%（VcZIP9和VcZIP11）。通過(guò)8個(gè)ZIP家族基因的轉(zhuǎn)膜域預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比篩選結(jié)果顯示，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具有ZIP家族的典型二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括8個(gè)轉(zhuǎn)膜域、C末端的短肽且在Ⅲ與Ⅳ轉(zhuǎn)膜域間存在一序列長(zhǎng)度多變的富含組氨酸的鏈。為進(jìn)一步確認(rèn)VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具備潛在的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)功能，將上述3個(gè)基因與擬南芥中AtIRT1～AtIRT3這3個(gè)典型金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)行聯(lián)配，分析結(jié)果顯示基因結(jié)構(gòu)類(lèi)似。因此，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究VcZIP4、VcZIP7和VcZIP9轉(zhuǎn)運(yùn)子的生物學(xué)功能。

將8個(gè)藍(lán)莓ZIP家族基因序列和30個(gè)已知植物ZIP家族基因序列聯(lián)配，并通過(guò)MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。結(jié)果顯示，根據(jù)分支長(zhǎng)度與垂直距離，VcZIP4與AtZIP6基因的進(jìn)化分歧時(shí)間短，蛋白質(zhì)相似性為67%；VcZIP7和AtZIP7基因的親緣關(guān)系較近，位于同一分支；VcZIP9基因同樣位于VcZIP7和AtZIP7所在分支。

2.2 添加金屬離子對(duì)藍(lán)莓表觀生長(zhǎng)情況的影響

1年生藍(lán)莓苗經(jīng)過(guò)Fe、Zn、Cd金屬水培處理30 d后，各處理組藍(lán)莓的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出典型特征（圖2）。對(duì)照處理（CK）生長(zhǎng)環(huán)境中，藍(lán)莓植株莖稈粗壯，葉片生長(zhǎng)茂盛且呈深綠色，根系發(fā)達(dá)，根尖有明顯伸長(zhǎng)；過(guò)量Fe組植株矮小，藍(lán)莓植株莖稈細(xì)長(zhǎng)，葉片緣呈杯狀卷起或卷皺，頂端葉片呈現(xiàn)銹色，根系生長(zhǎng)異常，局部呈現(xiàn)棕褐色；缺Fe組枝頂端嫩葉出現(xiàn)典型缺鐵癥狀，如脈間失綠黃化、葉片卷曲等，根系生長(zhǎng)受到明顯抑制，新根量低；過(guò)量Zn組藍(lán)莓植株較為矮小，枝條稀疏，葉片脫落嚴(yán)重，少數(shù)葉片葉尖出現(xiàn)褐色，生長(zhǎng)受到抑制；過(guò)量Cd組根尖呈黑褐色，嫩芽萎蔫，老葉葉緣呈褐色失綠；超量Cd組根系受損嚴(yán)重，脆弱易斷，嫩葉嚴(yán)重萎蔫，葉色由綠色轉(zhuǎn)褐色。

2.3 添加金屬離子水培處理對(duì)藍(lán)莓ZIP家族基因表達(dá)量的影響

利用分段克隆再拼接的方法成功分離得到藍(lán)莓VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9等3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子的全長(zhǎng)cDNA，并在此基礎(chǔ)上，采用定量PCR檢測(cè)VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9等3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。經(jīng)過(guò)不同金屬離子水培處理30 d后的藍(lán)莓植株中，其VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因的表達(dá)水平均表現(xiàn)出差異顯著（圖3）。在葉部，3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因轉(zhuǎn)錄水平普遍受到抑制，相對(duì)于對(duì)照，降幅為58.8%～99.9%。根部的變化則更為復(fù)雜，其中缺Fe、過(guò)量Fe以及超量Cd處理?xiàng)l件下藍(lán)莓根部的VcZIP4基因的表達(dá)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)錄水平分別為對(duì)照的5.3、86.5和45.4倍；VcZIP7基因的表達(dá)量在過(guò)量Fe處理?xiàng)l件下上調(diào)明顯，達(dá)到27.2倍，其余金屬離子過(guò)量的表達(dá)量無(wú)顯著變化（圖3B1、B2）；VcZIP9基因表達(dá)量在根際各金屬離子過(guò)量條件下表達(dá)量均大幅上升（圖3C1、C2），其中在過(guò)量Cd、超量Cd條件下分別達(dá)到對(duì)照的142.8倍和360.2倍。

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析與異源表達(dá)研究

2.4.1 △zrc1異源表達(dá)VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對(duì)鎘的耐性 鋅鎘敏感型突變體△zrc1轉(zhuǎn)化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在富鎘培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同長(zhǎng)勢(shì)，用于揭示ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子在酵母中對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。由圖4可知，在添加50 μmol·L-1 CdCl2處理的培養(yǎng)基上，與表達(dá)空載體pDR195的酵母菌株相比，轉(zhuǎn)化VcZIP4或VcZIP9提升了△zrc1突變體對(duì)鎘的耐受性，說(shuō)明轉(zhuǎn)化了VcZIP4或VcZIP9基因的酵母可以互補(bǔ)這一抑制表型；而轉(zhuǎn)化VcZIP7使得突變體對(duì)鎘更加敏感，生長(zhǎng)明顯受到抑制，這說(shuō)明VcZIP7的轉(zhuǎn)化提高了△zrc1突變體對(duì)鎘的敏感性，或在酵母中承擔(dān)介導(dǎo)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。

2.4.2 △smf1異源表達(dá)VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對(duì)錳的耐性 錳吸收缺陷型突變體△smf1轉(zhuǎn)化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在缺錳培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同長(zhǎng)勢(shì)，用于揭示ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子在酵母中轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力。由圖5可知，在正常培養(yǎng)基上，表達(dá)空載體pDR195的酵母生長(zhǎng)狀況均良好；在添加20 μmol·L-1 EGTA和15 mmol·L-1 MES的缺錳培養(yǎng)基上，表達(dá)VcZIP4和VcZIP9的突變體依舊生長(zhǎng)良好，而表達(dá)空載體pDR195或VcZIP7的突變體受到明顯的生長(zhǎng)抑制；說(shuō)明VcZIP4、VcZIP9基因能夠提高酵母對(duì)錳的吸收效率，或在酵母中承擔(dān)介導(dǎo)錳吸收的功能。

2.4.3 DDY4異源表達(dá)VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9后對(duì)鐵的耐性 鐵吸收缺陷型突變體DDY4轉(zhuǎn)化VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因后，在不同鐵濃度培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同長(zhǎng)勢(shì)，用于揭示ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子在酵母中轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力。由圖6可知，隨著pH5.6升至pH 5.8，培養(yǎng)基中可溶性鐵含量降低，表達(dá)空載體pDR195的酵母長(zhǎng)勢(shì)隨之發(fā)生減弱。然而，表達(dá)VcZIP4、VcZIP9、VcZIP7基因的酵母長(zhǎng)勢(shì)良好，特別是轉(zhuǎn)化VcZIP7或VcZIP9的酵母表現(xiàn)出了明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，與正常Fe濃度的培養(yǎng)基相比，其生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有受到抑制。因此得出推斷，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在酵母中或承擔(dān)介導(dǎo)鐵吸收的功能。

3 討論

藍(lán)莓對(duì)土質(zhì)要求極為嚴(yán)格，其Fe營(yíng)養(yǎng)具有明顯的低效性。同時(shí)，藍(lán)莓強(qiáng)烈的嗜酸性使根際其他重金屬被活化也極易導(dǎo)致藍(lán)莓的生理性重金屬中毒，這些因素嚴(yán)重影響藍(lán)莓的產(chǎn)量和質(zhì)量[18]。作為植物中最主要的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)子，ZIP家族基因主要參與了金屬元素的跨膜運(yùn)輸過(guò)程[8，24]。生物信息學(xué)分析顯示，藍(lán)莓ZIP金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中至少含有8個(gè)家族成員，在所構(gòu)建的ZIP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因分別歸屬于3個(gè)不同的大類(lèi)中，說(shuō)明這3個(gè)基因在進(jìn)化中距離較遠(yuǎn)，并不是相同基因的不同拷貝，或許在植物體內(nèi)承擔(dān)不同的功能[25]。也有學(xué)者認(rèn)為，ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子在第Ⅲ與Ⅳ轉(zhuǎn)膜域之間的這段富含組氨酸的鏈可能是ZIP基因結(jié)合金屬離子的靶位，對(duì)ZIP基因轉(zhuǎn)運(yùn)底物的選擇性具有決定作用[23]。因此，本研究重點(diǎn)對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行克隆及生物學(xué)功能的研究。

定量PCR結(jié)果顯示，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因?qū)υ诓煌慕饘偬幚斫M表現(xiàn)出完全不同的表達(dá)模式，在此基礎(chǔ)上推斷，VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在藍(lán)莓的生物學(xué)功能上可能存在一定的差異性[23]。VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因在根部的響應(yīng)均要強(qiáng)于葉部的響應(yīng)，這可能是由于上述基因主要在根部承擔(dān)離子吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[9]。當(dāng)根際Cd過(guò)量時(shí)，藍(lán)莓根部的VcZIP4和VcZIP9基因的表達(dá)量上調(diào)，但二者并不具備Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，推測(cè)VcZIP4和VcZIP9基因的過(guò)量表達(dá)可能是為了提高胞內(nèi)Fe等離子濃度以拮抗Cd毒害作用。在擬南芥[26]、水稻[27]中的研究同樣揭示了ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子的過(guò)量表達(dá)對(duì)于環(huán)境Cd毒害脅迫具有緩解作用。過(guò)量Zn（50 μmol·L-1）處理時(shí)，VcZIP4在藍(lán)莓葉及根部的表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯的變化，暗示該基因不參與鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)，與此類(lèi)似，水稻的OsIRT1亦僅具有轉(zhuǎn)運(yùn)Fe而不具備Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[28-29]。缺鐵條件下，VcZIP4和VcZIP9在根部的表達(dá)明顯上調(diào)，且轉(zhuǎn)基因酵母金屬耐性分析試驗(yàn)顯示二者均有轉(zhuǎn)運(yùn)Fe及Mn的功能，可見(jiàn)，VcZIP4和VcZIP9是根中的鐵響應(yīng)基因，介導(dǎo)鐵在根中的轉(zhuǎn)運(yùn)。VcZIP7使缺陷型酵母在缺鐵培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)最好，表明其具有高效的Fe轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但缺Fe處理?xiàng)l件下，VcZIP7的表達(dá)并未出現(xiàn)顯著上調(diào)，這可能是藍(lán)莓Fe營(yíng)養(yǎng)低效的重要原因。

本研究在一定程度上揭示了藍(lán)莓中ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)子家族的功能，在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步驗(yàn)證VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9基因的功能，可進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，探究不同金屬濃度處理對(duì)擬南芥生長(zhǎng)狀況的影響，以更深層次地探討上述基因的功能。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）