轉化生長因子β1通路在IgA腎病中作用機制的研究進展▲

孫昭恒 丁 櫻 郭 婷 黃文龍

(1 河南中醫藥大學兒科醫學院,河南省鄭州市 450046;2 河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科醫院,河南省鄭州市 450000)

【提要】 IgA腎病的發生、發展與機體異常免疫、腎臟炎癥反應、足細胞及腎小管上皮細胞的流失、細胞外基質的形成密切相關。轉化生長因子β1(TGF-β1)作為一種多功能細胞因子,不僅在維持免疫耐受、調節免疫應答方面發揮重要作用,還能夠調節多種類型細胞的生長、趨化、分化和凋亡,它的表達和活化與IgA腎病的發生、發展密切相關,對疾病后期腎纖維化的形成有重要作用,是影響患者預后的關鍵因素。通過TGF-β1 信號通路尋找治療IgA腎病的分子生物學靶點成為IgA腎病治療的新方向。現對TGF-β1通路在IgA腎病中的分子生物學機制進行綜述。

IgA腎病是全球最常見的原發性腎小球腎炎[1],其特點是以IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜區、毛細血管壁沉積[2],臨床表現包括無癥狀的尿檢異常(鏡下血尿和/或蛋白尿)、有明顯癥狀的腎臟異常(肉眼血尿、腎病綜合征),甚至進行性腎功能不全,高達50%的患者在確診后的20年內發展為終末期腎臟病[3]。既往研究表明,IgA腎病是由免疫炎癥介導的腎小球腎炎,但其發病機制尚未被完全闡明,目前最為公認的發病機制為多重打擊學說[4]:循環血中半乳糖缺乏的IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)水平升高,N-乙酰半乳糖胺暴露(打擊1),被IgG和/或IgA1同型的天然抗聚糖抗體所識別(打擊2),形成包含Gd-IgA1的循環免疫復合物,聚集在腎小球的系膜區(打擊3),刺激系膜細胞增殖,分泌系膜基質、細胞因子、趨化因子、生長因子等,同時激活補體系統,引起腎臟的免疫炎癥反應和纖維化改變(打擊4)。在這一系列復雜的免疫應答中,轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)作為一種多效性的信號分子,能夠激活多種復雜的信號通路,在IgA腎病發生與發展的不同階段起到不同的作用。本文總結了TGF-β1在IgA腎病發病不同階段的作用機制,對TGF-β1通路相關靶向藥物的研究進展進行綜述,旨在為調控 TGF-β1 通路治療IgA腎病提供理論依據。

1 TGF-β1通路概述

TGF-β家族有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5五種亞型,但哺乳動物僅有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型,它們雖然有著相似的分子結構,但由于氨基酸序列和激活狀態的不同,各亞型顯示出不同的功能和特性[5]。TGF-β1是含量最豐富的亞型,可由各種類型的腎細胞和炎癥細胞合成,它與TGF-β潛伏期相關蛋白、TGF-β結合蛋白形成潛在的復合體,分泌于細胞外基質中[6]。未被激活的TGF-β1在絲氨酸蛋白酶纖溶酶、活性氧、凝血酶反應蛋白1或整合素的作用下,經過蛋白水解而被激活[7-8]。被激活的TGF-β1與受體相互作用,可激活SMAD依賴和SMAD非依賴的下游信號[9-10],被激活的TGF-β1還可以與TGF-β Ⅱ型受體(TGF-β type 2 receptor,TBR2)相結合,導致TGF-β Ⅰ型受體(TGF-β type 1 receptor,TBR1)發生磷酸化并募集,這種TGF-β1-TBR1-TBR2的活化復合物可使SMAD2和SMAD3發生磷酸化,然后磷酸化的SMAD2、SMAD3進一步與SMAD4結合,形成SMAD復合物,從而反向調節編碼基因(如膠原蛋白、纖連蛋白、α-平滑肌肌動蛋白)和SMAD7基因的轉錄[11-12]。此外,TGF-β1還可以直接激活其他信號轉導通路。這些途徑包括絲裂原激活蛋白激酶途徑[12]、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑[13-14]、小鳥苷三磷酸結合蛋白(如Ras、Rho、Rac、Cdc42)、NOTCH信號通路[15-16]、整合素連接激酶與Wnt/β-連環素途徑[17-18],它們既可以作為獨立的信號通路,也可以作為匯聚到SMAD上的信號通路來抑制SMAD的活性,從而介導信號傳導。這些復雜的信號通路在TGF-β1調節細胞生長、分化、細胞外基質形成、免疫抑制等過程中起重要作用[19-20]。

TGF-β1的表達和活化與IgA腎病的發生、發展密切相關。一項隊列研究表明,IgA腎病患者血清TGF-β1水平升高,血清TGF-β1水平與血清IgA、分泌型IgA和Gd-IgA1水平,以及IgA腎病病理分型相關[21]。還有研究顯示,IgA腎病患者外周血γδT細胞細胞核中TGF-β1水平升高[22]。另一項研究表明IgA腎病患者血清和腎小球中TGF-β1蛋白和mRNA的表達水平明顯高于健康人群,且隨WHO關于IgA腎病病理分級的增加而增加[23]。以上研究均證明TGF-β1是IgA腎病發生與發展的關鍵因子。

2 TGF-β1在IgA腎病啟動環節中的作用:穩定或誘發

人體具有復雜的免疫機制,可以在準確清除細菌、病毒、真菌、寄生蟲等致病因素的同時,不對自身造成影響,從而維持機體平衡,這是由針對特定病原的效應器產生的免疫反應,以及調節性T細胞和抑制性細胞因子提供的反饋調節環路完成的[24]。調節性T細胞可以分為三種主要的CD4+調節性T細胞[25-27],其中兩種表達轉錄因子叉頭盒蛋白P3(forkhead box protein P3,FOXP3),可在天然調節性T細胞或誘導性調節性T細胞自然誘導下,抑制促炎因子的產生,對維持自身免疫耐受起著關鍵作用。第三種是Ⅰ型調節性T細胞,它不表達轉錄因子FOXP3,但在抗原刺激下可以分泌白細胞介素(interleukin,IL)-10和TGF-β1[28-30]。TGF-β1一方面能夠抑制Th1細胞、Th2細胞和細胞毒性T淋巴細胞的活性,誘導幼稚CD4+調節性T細胞產生轉錄因子FOXP3[31-32],并通過調節FOXP3+調節性T細胞抑制T細胞反應,在抑制T細胞反應中起著至關重要的作用[25];另一方面,TGF-β1可以抑制外周幼稚CD4+和CD8+T細胞的增殖、存活和反應性[33-34],對維持外周免疫穩態和保持T細胞抵御病原的侵害至關重要。既往研究發現,TGF-β1基因缺失的小鼠出生后會因全身炎癥反應而迅速死亡[35],這說明TGF-β1在抑制自身免疫性炎癥反應中起關鍵作用。

TGF-β1通路的激活可能與IgA腎病的發生相關。TGF-β1通路的激活進一步誘導原始T細胞分化為具有促炎作用的Th17細胞[36-37],介導機體的前炎癥反應,并與IL-10或IL-21一起誘導CD40激活的B細胞轉變為IgA+B細胞[38]。記憶B細胞在機體初次感染后即可形成,并在二次免疫反應中迅速產生以IgA為主的免疫球蛋白[39],這個過程促進了血液中IgA類抗體的大量形成。此外,TGF-β1還是一種IgA類轉換因子[40-41],它可通過SMAD2/3通路有效、獨立地激活抗體類別轉換[42]。如研究表明,TGF-β1可以負向調節B細胞的存活、增殖,并在成熟的B細胞向產生IgA的漿細胞分化的過程中,誘導免疫球蛋白與IgA發生類別轉換,促進IgA類抗體的產生[43]。同時,一些細胞因子也可以增強這種轉換能力,如IL-10及其他細胞因子可以促進TGF-β1介導的IgA發生抗體類別轉換[44-46]。也有研究發現,由濾泡輔助T細胞產生的TGF-β1和IL-21可以協同產生豐富的IgA漿母細胞。在IL-21的作用下,TGF-β1可促進幼稚B細胞的增殖和分化,并抑制IL-21誘導的IgG發生抗體類別轉換,從而促進IgA類抗體的產生[47],這些TGF-β1的相關通路促進了IgA類抗體的產生,使循環血中的IgA類免疫復合物增加,從而誘發IgA腎病的發生。

3 TGF-β1在IgA腎病發展環節中的作用:修復或破壞

在IgA腎病發展的不同階段,TGF-β1也發揮著不同的作用。在腎損傷早期的腎臟修復過程中,TGF-β1被證明是一種抗炎細胞因子[48]。最近研究表明,在新月體腎炎的小鼠模型中,TGF-β1會抑制炎癥細胞因子的釋放及巨噬細胞和CD3+T細胞的浸潤,以保護受損的腎臟[49]。TGF-β1也被證明可促進巨噬細胞由促炎的M1向抗炎的M2表型轉變[50],這些短期內通路的激活有利于腎臟的修復。然而,TGF-β1也會加重炎癥反應。隨著病情進展,IgA相關的免疫復合物沉積于腎臟,其與系膜細胞結合并被激活,觸發腎小球和腎間質損傷,使得腎小球濾過屏障受損,足細胞和近端腎小管上皮細胞很可能被持續暴露在IgA相關的免疫復合物中[51],這種持續的細胞水平的損傷促進了局部纖維蛋白凝塊的形成,并激活受損細胞的先天免疫反應[52-54],在這種炎癥反應下,受損的各類腎細胞及浸潤的炎癥細胞釋放細胞因子、趨化因子和生長因子,其中就包括TGF-β1,TGF-β1又能自我誘導內源性TGF-β1的合成,使TGF-β1進一步增多[55]。這些TGF-β1可使炎癥細胞聚集到損傷部位[56],進一步加重腎小球、腎間質中的炎癥反應。最近研究顯示,TGF-β1對炎癥反應是驅動還是抑制,是由細胞外TGF-β1的水平及暴露于TGF-β1時細胞內和細胞外的局部因素所決定的[57],這提示TGF-β1或許可以成為控制炎癥反應的重要靶點。

足細胞、足突是腎小球濾過膜的重要組成部分,正常情況下,足細胞通過自噬來維持其穩態[58],而IgA腎病過程中,足突廣泛融合,破壞足細胞自噬,導致足細胞功能障礙,出現形態異常、凋亡甚至脫落。隨著IgA腎病的進一步發展,腎小球濾過膜受損,患者往往出現蛋白尿、血尿。有研究顯示,由IgA腎病患者血液中的IgA1與系膜細胞組成的培養液可以誘導足細胞凋亡[59]。最近一項研究發現,TGF-β1可以通過激活雷帕霉素靶蛋白復合物通路來抑制足細胞自噬[60],從而破壞其穩態,并抑制足細胞內主要細胞骨架蛋白的表達[61],導致足細胞功能障礙。同時,TGF-β1和C-X-C基序趨化因子配體1的協同作用又可以通過C-X-C基序趨化因子受體2進一步誘導足細胞凋亡[62],這又造成足細胞的大量丟失,而足細胞丟失已被證實與IgA腎病的嚴重程度和疾病進展有關[63]。此外,受到IgA1刺激的系膜細胞又通過串擾激活足細胞的腎素-血管緊張素系統,使足細胞合成TGF-β1增多,從而使上述損傷加重[64-65]。文獻顯示,局部腎素-血管緊張素系統的激活和TGF-β1的合成是腎損傷的主要因素[66]。上述研究提示,在IgA腎病中,受到IgA相關免疫復合物刺激的腎小球系膜細胞可能通過促進TGF-β1的產生而加速疾病進展。

4 TGF-β1在IgA腎病后期進展中的作用:纖維化的形成

纖維化是指大量激活的成纖維細胞沉積形成富含膠原的細胞外基質,逐漸替代健康的實質組織,導致正常組織功能喪失,幾乎任何重復損傷或持續性損傷的組織都可以發展成纖維化。TGF-β1通路短期的激活可促進腎臟損傷修復,而持久的激活會導致腎臟纖維化。TGF-β的促纖維化作用最初是在動物研究中被發現的,研究團隊給新生小鼠皮下注射TGF-β后發現,TGF-β可刺激注射部位肉芽組織增生,并刺激成纖維細胞中膠原的形成[67]。最近研究發現,TGF-β1主要通過TGF-β1受體的激活、SMAD3的磷酸化和核轉位來促進腎纖維化的發展。在慢性腎臟病中,TGF-β1不僅能夠作用于腎臟系膜細胞和成纖維細胞,誘導細胞增殖、遷移,激活和轉錄促纖維化分子,包括膠原、纖維連接蛋白和纖溶酶原激活物抑制物1[68-70],還能夠調節蛋白質和miRNA的表達,影響組織膠原的積累,誘導超過12種蛋白質與膠原蛋白的表達,這些蛋白都是膠原蛋白在組織中大量表達、積累所必需的。膠原蛋白被誘導表達后,自發地結合成微纖維,同時,TGF-β1誘導纖維連接蛋白、賴氨酰氧化酶、膠原周轉抑制物等的表達,使這些物質成為穩定的基質纖維膠原,從而導致腎的纖維化[7]。

腎小球系膜細胞通過提供正確的機械張力,產生各種細胞因子、生長因子和金屬蛋白酶,調節細胞外基質的轉換,維持腎小球正常的功能。因此,腎小球系膜細胞也是慢性進行性腎臟疾病進展為腎臟纖維化的主要效應細胞[71],在多種因素觸發下,IgA腎病患者的腎小球系膜細胞被炎癥細胞因子激活,從而過度增殖[72],其增殖過程分泌大量TGF-β1[73],不僅進一步促進腎小球系膜細胞的增殖,還導致腎小管間質的纖維化。進行性的腎小管間質纖維化由生長因子、代謝毒素及應激分子等多種介質調控[74-76],TGF-β1被認為是其中關鍵的介質[77-79]。TGF-β1觸發腎小管上皮細胞轉化為間充質細胞來誘導纖維化,這一過程被稱為上皮-間質轉化[80]。同時,在腎小管上皮細胞中,TGF-β1可誘導自噬相關蛋白Beclin 1、自噬相關基因ATG5和ATG7的表達,并以時間和劑量依賴的方式促進自噬小體的聚集[81]。已有研究表明,這種TGF-β1驅動的自噬是腎小管分解的一種新機制,可導致腎間質纖維化:在疾病的初期,腎小管細胞內源性的TGF-β1可促進腎小管周圍細胞的增殖和膠原沉積;在疾病后期,TGF-β1的表達量持續升高,并通過調節細胞自噬過程使腎小管細胞完全分解,其分解的殘留物嵌入致密的膠原纖維組織中,導致管狀基底膜空洞、塌陷,引起廣泛的腎小管周圍纖維化和局灶性腎單位變性[82],使腎臟失去正常的組織結構,從而喪失正常功能。生物信息學研究發現,TGF-β1/SMAD3介導的以Src為中心的調控網絡誘導的巨噬細胞向肌成纖維細胞轉化是腎臟慢性炎癥進展為腎臟纖維化的關鍵靶點。Src位于差異表達基因網絡的中心,是一種廣泛表達的非受體蛋白酪氨酸激酶,可被多種細胞表面受體激活,參與多種信號通路[83]。近期研究表明,Gd-IgA1和血漿凝溶膠蛋白可通過TGF-β1/SMADs信號通路發揮協同作用,這也可能是誘導IgA腎病患者腎小球纖維化的一個潛在機制[84]。

5 TGF-β1在IgA腎病治療中的應用

基于TGF-β1治療IgA腎病的策略中,大致可分為以下兩種:(1)通過反義寡核苷酸、干擾RNA或中和抗體等方式直接抑制TGF-β1的功能或表達[85-87];(2)通過血管緊張素轉換酶抑制劑或阻斷血管緊張素Ⅱ受體等間接作用,減少腎組織TGF-β1的合成[88-90]。然而,如果直接靶向調控TGF-β1,TGF-β1的關鍵生理功能可能會由于TGF-β1通路的完全阻斷而中斷,包括抑制異常免疫、控制炎癥反應、維持自身耐受和預防自身免疫性疾病,繼而導致炎癥反應的增加,這種不利影響在小鼠身上表現得尤為突出[91]。因此,針對TGF-β1通路尋找新的靶點,以治療包括IgA腎病在內的慢性腎臟病,逐漸成為研究的熱點。在IgA腎病中,SMAD3被過度激活,上皮-間質轉化形成,加上炎癥細胞的聚集和膠原蛋白的積累,使得TGF-β1/SMAD3通路中的SMAD7降解被抑制[92],進而使體內TGF-β1/SMAD3/SMAD7信號傳導趨于平衡,以有效減少疾病后期的腎臟纖維化。3-去氮腺嘌呤A可以通過抑制zeste基因增強子同源物2的表達、增加SMAD7和磷酸酯酶與張力蛋白同源物的表達來抑制TGF-β1/SMAD3信號轉導,從而抑制腎肌成纖維細胞的激活和腎纖維化的發展,還能有效抑制腎小管上皮細胞阻滯在G2/M期,減少TGF-β1和結締組織生長因子的產生,減輕單側輸尿管梗阻小鼠模型腎的纖維化[93]。細胞分裂自身抗原1是最近發現的TGF-β1信號的增強因子,也是抗炎因子NAD-依賴性去乙酰化酶sirtuin-1的抑制劑。以細胞分裂自身抗原1為靶點,采用干擾RNA技術抑制其表達,可以減弱TGF-β1誘導的SMAD3磷酸化,使纖維化靶基因的表達降低,從而抑制腎臟纖維化。該干預方法不會完全阻斷TGF-β1信號而影響其關鍵生理功能[94],與直接靶向調控TGF-β1或其受體相比,干擾細胞分裂自身抗原1表達的安全性更好,因此,細胞分裂自身抗原1可能是減少腎臟纖維化的有效、安全的靶點[95]。另有研究表明,腫瘤抑制因子p53是TGF-β1纖維化反應基因轉錄的協同調節因子,其可以與TGF-β1激活的SMADs通路結合,而通過藥理學和遺傳學方法靶向下調p53的表達,可以減弱相關基因的表達,減輕纖維化反應[96]。此外,一些促纖維化的下游效應因子也可能成為抑制纖維化的靶點。如纖溶酶原激活物抑制物1是一種絲氨酸蛋白酶抑制物[97],能夠抑制纖溶酶原激活系統。研究發現,纖溶酶原激活物抑制物1的特異性抑制劑SK-216可以阻斷TGF-β1通路誘導的上皮-間質轉化,減少A549細胞產生的纖溶酶原激活物抑制物1和內源性TGF-β1,從而減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化程度,這個過程可能不是通過抑制SMAD或由細胞外調節蛋白激酶通路介導的[98],但仍可以作為一個潛在的抑制腎臟纖維化的靶點。

6 小結與展望

TGF-β1信號通路在IgA腎病的啟動環節、發展環節及后期進展環節中均起到重要作用,它可以維持免疫耐受、發揮抗炎效應,又能在特定情況下加重炎癥反應,促進體內免疫復合物的產生;它既是腎臟損傷時細胞愈合的主要調節者,也可能會使平衡從生理性修復轉向過度的病理修復,產生以膠原瘢痕組織堆積、硬化為特征的纖維化,損害器官功能,導致器官功能衰竭。后續還需進一步研究IgA腎病中各類異常免疫應答之間的關系,明確疾病不同階段 TGF-β1 信號通路的表達情況和相應的分子機制,深入了解 TGF-β1 信號通路在IgA腎病發生與發展中的作用機制,尋找安全、有效的靶點,為IgA腎病的靶向治療提供指導依據。