基于生物信息學方法分析B3GNT7基因在甲狀腺癌組織中的表達水平及其對免疫細胞浸潤的影響▲

王加中 曹 罡 劉 陽 陳 碩

(西安交通大學第二附屬醫院普通外科,陜西省西安市 710061)

近年來,甲狀腺癌的發病率呈逐年上升趨勢[1-2],其發病機制備受關注,其中基因表達差異在甲狀腺腫瘤發病中具有重要作用[3]。β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶7(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7,B3GNT7)是β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉移酶家族成員之一,β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉移酶參與腫瘤免疫應答過程,與多種腫瘤的發生和發展密切相關[4-6]。目前有關B3GNT7基因在甲狀腺癌發病機制中的作用研究較少。因此,本文通過生物信息學方法探討B3GNT7基因在甲狀腺癌組織與癌旁組織中的表達差異,并分析其對甲狀腺癌組織免疫細胞浸潤的影響,為甲狀腺癌發病機制的研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 B3GNT7在甲狀腺癌組織及癌旁組織中的表達情況 在腫瘤免疫評估資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)的Diff Exp模塊中輸入B3GNT7基因,檢索B3GNT7基因在各類癌組織及其配對的癌旁組織中的表達情況;在GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)中檢索并分析B3GNT7基因在甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織中的表達情況。

1.2 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的表達情況 在UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)的TCGA模塊中輸入B3GNT7基因,分析不同淋巴結轉移情況、病理類型、種族的甲狀腺癌患者癌組織中B3GNT7基因的表達情況;在GEPIA2數據庫的Single Gene Analysis模塊中輸入B3GNT7基因,分析不同病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中B3GNT7基因的表達情況。

1.3 B3GNT7基因與甲狀腺癌免疫細胞浸潤的相關性分析 在TIMER數據庫的Survival模塊Gene Symbols項目中輸入B3GNT7基因,腫瘤類型選擇甲狀腺癌,臨床特征選擇年齡、性別、病理類型、腫瘤純度,免疫細胞選擇B淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞,采用多因素COX風險回歸模型分析B3GNT7基因表達水平對甲狀腺癌患者預后的影響;在TIMER數據庫Gene模塊Gene Symbols項目中輸入B3GNT7基因,腫瘤類型選擇甲狀腺癌,免疫細胞選擇B淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞,采用Spearman相關性模型分析B3GNT7基因表達水平與免疫細胞浸潤豐度的相關性;在TIMER數據庫SCNA模塊中分析B3GNT7基因拷貝數變異與免疫細胞浸潤豐度的關系;在TIMER數據庫Correlation模塊中分析B3GNT7基因表達水平與免疫細胞標志物、免疫檢查點基因、不同類型T淋巴細胞的基因標志物表達水平的相關性。

1.4 統計學分析 采用TIMER、UALCAN、GEPIA2數據庫在線數據集提供的統計方法進行分析,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 B3GNT7基因在多種腫瘤組織及其配對的癌旁組織中的表達水平 TIMER數據庫信息顯示,相較于配對癌旁組織,B3GNT7基因在膽管癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌癌組織中呈高表達,在結腸癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、肝細胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺癌、直腸腺癌、頭頸鱗狀細胞癌癌組織中呈低表達(均P<0.05),而在膀胱尿路上皮癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、卵巢癌等癌組織中的表達水平差異均無統計學意義(均P>0.05),見圖1。GEPIA2數據庫信息顯示,甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達水平高于癌旁組織(P<0.05),見圖2。

圖1 B3GNT7基因在多種癌組織及其配對的癌旁組織中的表達水平

圖2 B3GNT7基因在甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織中的表達水平

2.2 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的表達水平 不同病理分期的甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達水平比較,差異有統計學意義(P=0.026),不同病理類型、淋巴結轉移情況、種族的甲狀腺癌患者癌組織中的B3GNT7基因表達水平比較,差異均無統計學意義(P=0.506、0.0805、0.367),見圖3。

圖3 B3GNT7基因在不同臨床特征、病理類型的甲狀腺癌患者癌組織中的表達差異

2.3 B3GNT7基因與免疫細胞浸潤的相關性分析

2.3.1 B3GNT7基因表達水平、免疫細胞表達水平與甲狀腺癌患者預后的關系:多因素COX回歸分析結果顯示,CD8+T淋巴細胞、B3GNT7基因表達水平是甲狀腺癌患者預后的影響因素(均P<0.05),見圖4。

圖4 免疫細胞表達水平、B3GNT7基因表達水平與甲狀腺癌患者預后關系的多因素COX回歸分析

2.3.2 B3GNT7基因表達水平與免疫細胞浸潤的相關性:Spearman相關性分析結果顯示,B3GNT7基因表達水平與B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞浸潤豐度有關(均P<0.05),而與腫瘤純度無明顯相關性(P>0.05),見圖5。B3GNT7基因拷貝數變異影響B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞的浸潤豐度,見圖6。

圖5 Spearman相關性分析圖

圖6 B3GNT7基因拷貝數變異對免疫細胞浸潤豐度的影響

2.3.3 B3GNT7基因表達水平與免疫細胞標志物和T淋巴細胞標志物表達水平的相關性分析:Spearman相關性分析結果顯示,B3GNT7基因表達水平與CD3D、CD3E、CD2、CD8A、CD8B、CD86、集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor 1 receptor,CSF1R)、CD68、干擾素調節因子5(interferon regulatory factor 5,IRF5)、前列腺素內過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)、誘導型一氧化氮合酶2(inducible nitric oxide synthase 2,iNOS2)、CD163、V-set和免疫球蛋白結構域4(V-set and immunoglobulin domain containing 4,VSIG4)、癌胚抗原相關細胞附著分子8(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8,CEACAM8)、整聯蛋白αM(integrin alpha M,ITGAM)、C-C基序趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor,CCR)7、人類白細胞抗原DPB1(human leukocyte antigen DPB1,HLA-DPB1)的表達水平均有關(均P<0.05),見表1。B3GNT7基因表達水平與T淋巴細胞標志物如信號轉導因子和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)4、STAT1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、堿性/螺旋-環-螺旋蛋白基因(basic helix-loop-helix,bHLH)E40、CD4、人叉頭框蛋白P3(forkhead box P3,FOXP3)、白細胞介素2受體α(interleukin 2 receptor alpha,IL2RA)、 CCR8、腫瘤壞死因子受體超家族成員9(TNF receptor superfamily member 9,TNFRSF9)、CCR7、L-選擇素(selectin L,SELL)、粒溶酶K(granzyme K,GZMK)、CD69、白細胞介素7受體(interleukin 7 receptor,IL7R)、甲肝病毒細胞受體2(hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)的表達水平均有關(均P<0.05),見表2。

表1 B3GNT7基因表達水平與免疫 細胞標志物表達水平的相關性分析

表2 B3GNT7基因表達水平與T淋巴 細胞標志物表達水平的相關性分析

2.3.4 B3GNT7基因表達水平與免疫檢查點基因表達水平的相關性分析:Spearman相關性分析結果顯示,B3GNT7基因的表達水平面與細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)的表達水平密切相關(P=0.037),與CD274、細胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PDCD1)的表達水平無明顯相關性(P=0.418、0.557),見圖7。

圖7 B3GNT7基因與免疫檢查點基因相關性

3 討 論

近年來,甲狀腺癌發病率居高不下,乳頭狀癌是其主要的病理類型[7],以手術為主的綜合治療對甲狀腺乳頭狀癌的效果較好,但對甲狀腺髓樣癌、未分化癌的治療效果欠佳[8]。目前已知多種基因參與甲狀腺癌的發生與發展,但其具體機制仍未完全明確,基因表達差異、腫瘤微環境等因素均可能參與甲狀腺癌的發病過程[9-11]。腫瘤組織由腫瘤細胞及周圍的微環境構成,腫瘤微環境包括各種類型的細胞和細胞外基質,其中免疫細胞是腫瘤微環境中的關鍵細胞[12]。腫瘤細胞可通過調控基因表達或者分泌細胞免疫抑制因子等機制,影響免疫應答信號通路,發生腫瘤免疫逃逸,使腫瘤微環境中的免疫細胞無法發揮其抗腫瘤作用[13-15]。腫瘤微環境中免疫細胞的浸潤程度是腫瘤發病機制研究的熱點,各種免疫細胞及基因檢測方法的發展使得腫瘤免疫研究進入大數據時代,多個數據庫中的基因數據集及生物信息分析軟件成為基于生物信息學方法分析腫瘤發生與發展的重要研究手段[16-17]。

B3GNT7是糖基轉移酶β-3-N乙酰氨基葡萄糖轉移酶家族8個亞族成員之一,定位于19q13.2,由3個外顯子和2個內含子組成,其主要功能是催化還原糖蛋白末端N-乙酰半乳糖胺與絲氨酸或蘇氨酸形成的α-糖苷鍵,在人體多種組織中均有表達,有學者發現B3GNT7基因與結直腸癌的發病機制有關[18]。本研究結果顯示,B3GNT7基因在膽管癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌等患者的癌組織中呈高表達,且B3GNT7基因表達與甲狀腺癌患者的病理分期密切相關,在甲狀腺癌發病機制中可能起重要作用。本研究的COX回歸模型分析結果顯示,CD8+T淋巴細胞、B3GNT7基因表達水平是甲狀腺癌患者預后的影響因素(均P<0.05),相關性分析結果顯示B3GNT7基因表達水平與B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞浸潤豐度相關,且與多種免疫細胞標志物表達水平密切相關,而且B3GNT7基因拷貝數的變異亦明顯影響CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞的浸潤豐度,這表明甲狀腺癌細胞中B3GNT7基因可能通過某些信號途徑影響腫瘤微環境中免疫細胞的浸潤,引起腫瘤免疫逃逸。研究表明,B3GNT7蛋白可催化還原細胞表面糖蛋白,通過改變腫瘤細胞表面特異性糖鏈結構,逃避免疫細胞識別[19],這可能是B3GNT7基因與腫瘤微環境中免疫細胞浸潤豐度密切相關的原因。

CTLA4是免疫球蛋白超家族的成員,通過與抗原呈遞細胞上的B7-1結合,向T淋巴細胞傳遞免疫抑制信號,與橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫疾病的發病相關[20-21]。CTLA4的阻斷抗體伊匹單抗用于黑色素瘤的治療已取得較好的效果,是一種潛在的免疫治療手段[22]。本研究結果顯示,B3GNT7基因表達水平與CTLA4表達水平密切相關,而與CD274、PDCD1表達水平無明顯相關,這提示CTLA4的阻斷抗體具有成為甲狀腺癌患者免疫治療方式的潛在價值,而PD1/PDL1免疫療法可能對甲狀腺癌患者的治療效果有限。

綜上所述,本研究通過生物信息學方法發現B3GNT7基因在甲狀腺癌組織中呈高表達,其表達水平與甲狀腺癌患者的病理分期密切相關,B3GNT7基因與甲狀腺癌組織中B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞的浸潤豐度相關,且與CTLA4表達密切相關,但其參與調節免疫細胞浸潤的具體機制仍有待進一步探索。