姜黃素對人視網膜色素上皮細胞增殖和VEGF表達的影響▲

鄭海生 藍育青 徐家窈 陳海燕 鐘興武

[1 中山大學中山眼科中心海南眼科醫(yī)院(海南省眼科醫(yī)院,海南省眼科學重點實驗室)眼科,海南省海口市 570311;2 中山大學附屬孫逸仙紀念醫(yī)院眼科,廣東省廣州市 510120]

在眼底新生血管性疾病中,視網膜缺氧可導致各種細胞因子釋放,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被認為是與新生血管聯(lián)系最緊密的一個因子。無論是在體內還是體外實驗中,視網膜色素上皮細胞缺氧均可誘導VEGF表達,從而促進眼內血管新生[1]。因此,尋找一種能有效抑制眼底新生血管性疾病患者視網膜色素上皮細胞增殖和VEGF表達,且毒副作用較少的方法尤為重要。姜黃素具有多種療效[2-4],其在防治眼底新生血管性病變中可以發(fā)揮抗新生血管生成的藥理作用。目前有關姜黃素的藥物代謝動力學及其在癌癥治療方面的研究較多[5-6],但關于姜黃素對人視網膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)細胞的作用研究仍較少。本研究探討姜黃素對體外培養(yǎng)的hRPE細胞增殖及VEGF表達的影響,為尋找一種安全有效的防治眼底新生血管性疾病的藥物提供初步的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器設備

1.1.1 主要試劑:姜黃素(Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司,批號:SHBL0796),胎牛血清(Biological Industries公司,批號:2033119),波形蛋白單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司,批號:M00235),TRIzol試劑盒(TaKaRa公司,批號:AJ91799A),實時熒光半定量PCR試劑盒(TaKaRa公司,批號:RR019A),DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司,批號: 61100087)。hRPE細胞由中山大學附屬眼科中心醫(yī)院提供,選第3～6代細胞用于實驗。

1.1.2 主要儀器設備:光學倒置顯微鏡(Leica公司,型號:MPS-30)、Axioplan 2 imaging熒光顯微鏡(Zeiss公司)、流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號:FACSCalibur)、Wellscan MK3酶標儀(Labsystems公司)、GeneAmp 2700型PCR儀(SYNGENE公司)、恒壓恒流電泳儀(Bio-Rad公司,型號:PowerPac通用型)、GeneGenius型凝膠成像儀(SYNGENE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8法檢測姜黃素對hRPE細胞增殖的影響:取處于對數(shù)生長期的hRPE細胞,用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基制備密度為2 500個/mL的細胞懸液,將細胞懸液(100 μL/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中,再將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;待細胞貼壁生長至單層后棄掉培養(yǎng)液,各濃度組分別在每孔中加入100 μL含終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黃素的DMEM-F12培養(yǎng)基,同時設置空白對照組(加入等量培養(yǎng)液),再將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d后,棄掉培養(yǎng)液,向每孔中加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基及10 μL CCK-8,繼續(xù)放入37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的各孔吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率,并繪制時間-劑量效應曲線。增殖抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。每組設4個復孔,實驗重復3次。

1.2.2 流式細胞儀檢測姜黃素對hRPE細胞周期時相的影響:取處于對數(shù)生長期的hRPE細胞,以5×105個/mL的密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,每瓶5 mL,24 h后加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基,繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h,然后吸出DMEM-F12培養(yǎng)液,各濃度組再加入5 mL含終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL姜黃素的DMEM-F12培養(yǎng)液作用24 h,設置空白對照組并加入等量培養(yǎng)液,收集貼壁細胞,采用流式細胞儀分析細胞周期分布情況。每組實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光半定量PCR檢測姜黃素對hRPE細胞VEGF mRNA表達水平的影響:(1)細胞分組和處理。取處于對數(shù)生長期的hRPE細胞,以5×105個/mL接種于六孔板中,每孔2 mL,將其分為對照組和姜黃素組。對照組細胞僅加入2 mL DMEM-F12培養(yǎng)液,姜黃素組加入用細胞培養(yǎng)液稀釋的終濃度為10 μg/mL的姜黃素,每組設4個復孔,放入37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。(2)PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。VEGF上游引物序列為5′-GACAAGAAAATCCCTGTGGGC-3′,下游引物序列為5′-AACGCGAGTCTGTGTTTTTGC-3′,擴增片段理論長度為102 bp;內參β-actin上游引物序列為5′-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3′,下游引物序列為5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′,擴增片段理論長度為 428 bp。(3)實時熒光半定量PCR。采用TRIzol試劑盒提取各組細胞的總RNA,將RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板,按實時熒光半定量PCR試劑盒說明書步驟擴增目的基因。反應體系為10×PCR Buffer Ⅱ 5 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL,上下游引物各0.5 μL,TaKaRa Ex TaqTMHS(5 U/μL)0.5 μL,cDNA模板 4.5 μL,加RNase Free dH2O至50 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min;共進行33個循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃延伸8 min。(4)PCR擴增產物電泳。取4 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測其完整性;攝像后利用凝膠圖像掃描分析軟件分析電泳結果,測定電泳條帶的光密度值。以VEGF的PCR產物含量與β-actin的PCR產物含量的比值來表示VEGF mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度姜黃素對hRPE細胞增殖的影響 各濃度姜黃素(濃度≥5 μg/mL)對hRPE細胞均有抑制作用(均P<0.05),且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長,其抑制率呈升高趨勢,整體呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。見表1。

表1 不同濃度姜黃素對hRPE細胞增殖的影響(x±s)

組別n培養(yǎng)4 dOD值(x±s)抑制率(%)培養(yǎng)5 dOD值(x±s)抑制率(%)培養(yǎng)6 dOD值(x±s)抑制率(%)5 μg/mL姜黃素組30.554±0.010a64.00.602±0.015a62.70.591±0.022a63.610 μg/mL姜黃素組30.510±0.014ab66.90.564±0.023ab65.10.518±0.016ab68.120 μg/mL姜黃素組30.114±0.009abc92.60.096±0.016abc94.10.036±0.012abc97.840 μg/mL姜黃素組30.103±0.012abcd93.30.089±0.012abcd94.50.030±0.008abcd98.2空白對照組31.542±0.009—1.612±0.015—1.621±0.013— F值8 562.2044 188.6535 653.264P值<0.001<0.001<0.001

2.2 不同濃度姜黃素對hRPE細胞周期時相的影響 各濃度姜黃素組的G0/G1期細胞比例均大于空白對照組,S期細胞比例和G2/M期細胞比例均小于空白對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組hRPE細胞周期 時相分布情況的比較(x±s,%)

2.3 姜黃素對hRPE細胞VEGF mRNA相對表達水平的影響 因20 μg/mL和40 μg/mL姜黃素對細胞增殖的抑制作用太強,而5 μg/mL姜黃素的抑制性偏弱,所以選擇10 μg/mL姜黃素進行該實驗。結果顯示,姜黃素組hRPE細胞VEGF mRNA相對表達水平低于對照組(P<0.05),見表3。

表3 兩組hRPE細胞VEGF mRNA 相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

姜黃素是一種藥理作用廣泛的傳統(tǒng)中藥,其藥源廣,價格低廉,無明顯毒副作用,目前美國食品藥品監(jiān)督管理局將其作為21世紀抗癌新藥[7],并且已有學者研究姜黃素的藥物代謝動力學及其治療癌癥的生物有效劑量[8-9]。而姜黃素在眼科疾病中應用的研究主要集中于其抗新生血管生成的作用,多項研究顯示,姜黃素可能在翼狀胬肉、角膜堿燒傷和糖尿病視網膜病變等疾病的治療中發(fā)揮重要作用[10-12]。龔凌等[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯抑制人胚胎視網膜色素上皮細胞增殖。本研究結果顯示,各濃度姜黃素(濃度≥5 μg/mL)對hRPE細胞均有抑制作用(均P<0.05),且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長,其抑制率呈升高趨勢,整體呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。本研究結果還顯示,各濃度姜黃素組的G0/G1期細胞比例均大于空白對照組,S期細胞比例和G2/M期細胞比例均小于空白對照組(均P<0.05)。這說明姜黃素可以將hRPE細胞周期阻滯于S期,即進入細胞增殖期的hRPE細胞比例降低,這可能是姜黃素抑制hRPE細胞增殖的重要原因之一[14]。李松霖等[15]的研究結果顯示,姜黃素作用于Lewis肺癌細胞24 h 后,Lewis肺癌細胞的凋亡率升高至7.43%,且姜黃素可以將Lewis肺癌細胞周期阻滯于S期。這與本研究結果相似。

視網膜色素上皮細胞在視網膜新生血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用,在缺氧的環(huán)境下視網膜色素上皮細胞可誘導VEGF表達,而VEGF在視網膜新生血管病變中起著非常重要的作用。Vasquez等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃素既能抑制缺氧誘導的視網膜色素上皮細胞VEGF表達上調,又能抑制脈絡膜血管細胞的血管生成;Mrudula等[10]發(fā)現(xiàn),姜黃素可以抑制糖尿病大鼠視網膜VEGF的表達,從而抑制眼底新生血管生成。因此我們提出假設:姜黃素可通過抑制hRPE細胞分泌VEGF,從而起到抑制眼底新生血管增生的作用。本研究通過實時熒光半定量PCR檢測姜黃素對hRPE細胞VEGF mRNA表達水平的影響,對姜黃素防治眼底新生血管性疾病的分子機制進行初步探索。結果顯示,姜黃素組hRPE細胞VEGF mRNA相對表達水平低于對照組(P<0.05),說明姜黃素能下調hRPE細胞VEGF mRNA的表達,與上述研究結果基本一致。然而姜黃素在下調hRPE細胞VEGF mRNA相對表達水平的同時,是否也能下調其蛋白表達水平尚需進一步研究。

綜上所述,姜黃素可以將hRPE細胞周期阻滯于S期,從而抑制hRPE細胞的增殖,還可以降低hRPE細胞的VEGF mRNA表達水平。這為進一步的體內實驗提供了研究基礎,為姜黃素防治眼底新生血管性疾病的新藥研發(fā)提供了初步的理論依據(jù)。