Box-Behnken 響應(yīng)面法結(jié)合信息熵法優(yōu)化葛枳湯提取工藝*

鄭文麗，魏艷婷，李佳佳，趙玉斌，彭安堂

（1. 河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051； 2. 河北省石家莊市第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011；3. 河北省石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊 050011； 4. 河北省石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051）

葛枳湯由葛花、桑椹、枳椇子、決明子等藥味組方，具有解酒保肝、明目解毒功效［1-2］，臨床應(yīng)用效果良好，故對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為其新劑型的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。Box - Behnken 響應(yīng)面法可連續(xù)分析試驗(yàn)的各個(gè)水平，減少試驗(yàn)次數(shù)，還可考察影響因素間的交互作用，所得結(jié)果直觀、可靠［3］。本研究中對(duì)葛枳湯的4 種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box- Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以信息熵法賦予權(quán)重系數(shù)，計(jì)算綜合評(píng)分，優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得最佳提取工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD - 20A 型紫外檢測(cè)器；98 - 1B 型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；YP2002型電子天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司，精度為10 mg）；TG328B型分析天平（上海精科儀器廠，精度為萬(wàn)分之一）；RE-52 型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HCP-100 型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）。

1.2 試藥

桑椹、葛花、枳椇子、決明子等中藥飲片均購(gòu)自石家莊樂仁堂藥店，均經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔副教授鑒定為正品；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為100080 - 200707，含量為90.5%），槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081-201610，含量為99.1%），橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)為111900 -201605，含量為98.3%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鳶尾苷對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)為F1180581，含量為98.0%）；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提液制備

按處方工藝稱取葛枳湯各組方中藥飲片，加8倍量水，浸泡0.5 h，補(bǔ)足吸水量，提取2 h，濾過，濾渣加8 倍量水，提取1 h，濾過，合并濾液，即得。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定指標(biāo)成分含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)5%A →15%A，10～17 min時(shí)15%A →19%A，17～27 min 時(shí)19%A，27～50 min 時(shí)19%A →40%A，50～70 min時(shí)40%A →50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以鳶尾苷峰計(jì)不低于3 000，各色譜峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素質(zhì)量濃度分別為0.160，0.200，0.192，0.128 mg/mL 的單一對(duì)照品溶液，冷藏，備用。取上述單一對(duì)照品溶液各適量，加甲醇制成蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的質(zhì)量濃度分別為48，80，36，1.95μg/mL的混合對(duì)照品溶液，冷藏，備用。

供試品溶液：取2.1 項(xiàng)下水提液，離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮至每1 mL含1 g飲片量，取濃縮液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，充分振蕩使溶解，靜置5 min，取上清液，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取空白對(duì)照溶液（甲醇溶液）及2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)色譜峰，表明方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

1. 蘆丁 2. 鳶尾苷 3. 槲皮素 4. 橙黃決明素A. 混合對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Rutin 2.Iridoid 3.Quercetin 4.Aurantio-obtusinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液各適量，分別用甲醇稀釋并定容，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以各成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察及檢測(cè)限與定量限確定結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantification

檢測(cè)限與定量限確定：取2.2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液各適量，用甲醇逐級(jí)稀釋，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.68%，1.98%，1.96%，0.95%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下水提液適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.91%，1.76%，1.65%，1.94%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，分別于2，6，10，12，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.28%，1.87%，1.31%，0.96%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取2.1項(xiàng)下已知含量的水提液1 mL，平行6份，分別按蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素含量的1∶1 加入對(duì)照品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按線性回歸方程分別計(jì)算各成分的含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的平均加樣回收率分別為99.88%，99.99%，99.93%，100.38%，RSD分別為0.29%，0.10%，0.48%，0.95%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 提取工藝單因素考察

粉碎粒度：按處方工藝稱取各中藥飲片3 份，進(jìn)行飲片、粗粉、細(xì)粉3 種粉碎粒度處理，分別加入8 倍量水，浸泡0.5 h，提取2 次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。根據(jù)指標(biāo)成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權(quán)重［4］確定合理粉碎粒度。結(jié)果綜合評(píng)分隨飲片粉碎粒度減小而降低，粉碎粒度為飲片時(shí)綜合評(píng)分最高，故選擇粉碎粒度為原藥材飲片。詳見圖2 A。

A. 粉碎粒度 B. 浸泡時(shí)間 C. 加水量 D. 提取時(shí)間 E. 提取次數(shù)圖2 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果A.Crushing particle size B.Soaking time C.Water addition amount D.Extraction time E.Extraction timesFig.2 Results of the single factor test

浸泡時(shí)間：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，將飲片分別浸泡0，0.5，1.0，1.5，2.0 h，分別加入8 倍量水，提取2次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。根據(jù)指標(biāo)成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權(quán)重確定合理浸泡時(shí)間。結(jié)果綜合評(píng)分隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，飲片浸泡0.5 h 時(shí)的綜合評(píng)分最高，故選擇浸泡時(shí)間為0.5 h。詳見圖2 B。

加水量：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，固定飲片浸泡0.5 h，分別加入6，8，10，12，14倍量水，提取2次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。根據(jù)指標(biāo)成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權(quán)重確定合理加水量。結(jié)果綜合評(píng)分隨加水量的增加先上升后下降，加8倍量水時(shí)的綜合評(píng)分最高，故選擇加8倍量水。詳見圖2 C。

提取時(shí)間：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，固定飲片浸泡0.5 h，加8 倍量水，分別提取1，2，3，4，5 h，提取2 次，即得水提液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。根據(jù)指標(biāo)成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權(quán)重確定合理提取時(shí)間。結(jié)果綜合評(píng)分隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升- 平緩- 下降趨勢(shì)，提取時(shí)間為3，4 h 時(shí)的綜合評(píng)分最高，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，故選擇提取3 h。詳見圖2 D。

提取次數(shù)：按處方工藝稱取各中藥飲片3 份，固定飲片浸泡0.5 h，加8 倍量水，分別提取1 次、2 次、3 次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。根據(jù)指標(biāo)成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權(quán)重確定合理提取次數(shù)。結(jié)果綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加先上升后平緩，提取2次時(shí)的綜合評(píng)分最高，故選擇提取2次。詳見圖2 E。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為提高試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性與科學(xué)性，更客觀、準(zhǔn)確地了解各成分在不同提取條件下的變化規(guī)律，減少主觀因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，選取提取時(shí)間（因素A）、提取次數(shù)（因素B）和加水量（因素C）3 個(gè)重要影響因素為變量，以蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用Box- Behnken 模型設(shè)計(jì)三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)［5］，其中12 個(gè)析因試驗(yàn)、5個(gè)中心試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box - Behnken test

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the Box - Behnken test

2.4.2 信息熵法確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)及綜合評(píng)分［6］

根據(jù)公式（1）對(duì)表3 中4 個(gè)指標(biāo)成分的含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（Xij）mn和概率矩陣（Pij）mn。根據(jù)公式（2）計(jì)算各指標(biāo)成分的Hi，結(jié)果Hi=［0.985 8，0.969 8，0.978 5，0.962 8］；根據(jù)公式（3）計(jì)算各指標(biāo)成分的權(quán)重系數(shù)Wi，結(jié)果Wi=［0.137 7，0.292 9，0.208 6，0.360 8］。根據(jù)公式M=（蘆丁含量/蘆丁含量max）×W1+（鳶尾苷含量/ 鳶尾苷含量max）×W2+（槲皮素含量/槲皮素含量max）×W3+（橙黃決明素含量/橙黃決明素含量max）×W4計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表3。

2.4.3 模型建立與方差分析

經(jīng)Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)表3 中的綜合評(píng)分進(jìn)行多元擬合分析，得Y對(duì)提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C）3 個(gè)變量的二次多元回歸模型Y=12.124 - 3.014A- 0.664B- 1.768C+ 0.109AB-0.030AC+0.098BC+0.506A2-0.054B2+0.110C2。由表4可知，建立的回歸方程模型F=10.01，P=0.003 1 ＜0.05，表明此擬合模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P=0.462 4 ＞0.05，差異不顯著，表明未知因素對(duì)結(jié)果干擾較小、試驗(yàn)誤差小。故可判斷所建立的回歸模型具有參考性，可用于葛枳湯提取工藝的理論預(yù)測(cè)［7］。由F值可知，在各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)成分提取的影響程度由大至小排序依次為B ＞C ＞A，即提取次數(shù)＞加水量＞提取時(shí)間，其中提取次數(shù)和加水量有顯著影響（P＜0.05）。R2=0.927 9，R2adj=0.835 2，表明該模型可解釋83.52%響應(yīng)值的變化。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the analysis of variance

2.4.4 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)表3 中的試驗(yàn)結(jié)果作圖，固定某一因素，可得任意2 個(gè)因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖［8］，詳見圖3?？梢?，因素AB 和BC 間的交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響較強(qiáng)，因素AC 間交互作用影響較弱，交互項(xiàng)影響強(qiáng)弱順序?yàn)锽C ＞AB ＞AC；提取次數(shù)（B）對(duì)綜合評(píng)分的影響最顯著，加水量（C）對(duì)綜合評(píng)分的影響較弱，提取時(shí)間（A）對(duì)綜合評(píng)分的影響所對(duì)應(yīng)的曲面坡度為非線性，表明其對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著，與表4 回歸方程模型的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

A. 提取次數(shù)與提取時(shí)間 B. 加水量與提取時(shí)間 C. 加水量與提取次數(shù)圖3 各影響因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的二維等高線和三維響應(yīng)面圖A.Extraction times and extraction time B.Water addition amount and extraction time C.Water addition amount and extraction timesFig.3 The 2D contour map and 3D response surface map of the interaction of various influencing factors on the comprehensive scores

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析得葛枳湯最優(yōu)提取工藝為加9 倍量水，提取3 次，每次分別提取90，45，45 min。此優(yōu)化提取工藝的綜合評(píng)分為0.981 9。

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按2.4.4 項(xiàng)下優(yōu)化得到的提取工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素含量和綜合評(píng)分的RSD分別為0.17%，2.79%，4.45%，0.52%，0.82%（n=3），與預(yù)測(cè)值的差異不超過1%，表明所建立的模型預(yù)測(cè)性良好。故基于響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可行，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。詳見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the verification test

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

葛枳湯化學(xué)成分復(fù)雜，單一成分作為含量測(cè)定指標(biāo)不能很好地反映中藥復(fù)方的特點(diǎn)，且單一成分的含量在飲片和制劑中不一定相同，制劑中各成分可能相互影響，故選擇多成分作為含量測(cè)定指標(biāo)評(píng)價(jià)葛枳湯的提取工藝具有一定科學(xué)性。

本研究中依據(jù)中藥處方的君臣佐使理論，選取主要有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，并通過信息熵法賦予各指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)，得到綜合評(píng)分，所優(yōu)選的工藝參數(shù)穩(wěn)定、可靠。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鳶尾苷作為君藥葛花的主要有效成分，對(duì)酒精代謝障礙及肝功能有改善作用，對(duì)酒精引起的臟器障礙及消化道功能障礙也有一定改善作用［9］；槲皮素為臣藥枳椇子的主要有效成分，對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用明顯，可減輕乙醇對(duì)肝組織的損傷［10］；蘆丁和橙黃決明素為佐使藥桑椹和決明子的主要有效成分，具有抗氧化、調(diào)血脂、保肝明目、降血糖等藥理作用［11-12］。故選取葛枳湯中鳶尾苷、槲皮素、蘆丁、橙黃決明素為指標(biāo)成分對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，既可兼顧指標(biāo)間的協(xié)同作用，又符合中醫(yī)用藥的整體觀念。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

對(duì)葛枳湯中的4個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)橙黃決明素、蘆丁、鳶尾苷、槲皮素分別在285，210，265，245 nm 波長(zhǎng)處有最大紫外吸收。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，于245 nm 波長(zhǎng)處被測(cè)成分均能出峰，且蘆丁、橙黃決明素檢測(cè)靈敏度好，色譜峰峰形較好，各色譜峰分離度適中。為使各組分在同一波長(zhǎng)下都能有較好吸收，達(dá)到吸收強(qiáng)、干擾小的目的，最終選擇245 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 試驗(yàn)方法選擇

本研究中首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，確定對(duì)結(jié)果產(chǎn)生主要影響的因素及水平，為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考；響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)充分考慮各因素的交互作用，所得結(jié)果具有一定客觀性，且預(yù)測(cè)值與真實(shí)值較接近，可信度較好，試驗(yàn)精確度較高［13］。信息熵理論能科學(xué)地賦予各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，避免主觀因素對(duì)結(jié)果的干擾。驗(yàn)證試驗(yàn)可證實(shí)優(yōu)選的提取工藝是否穩(wěn)定、可行。故本研究中選擇在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box- Behnken 響應(yīng)面法結(jié)合信息熵法優(yōu)選提取工藝，并對(duì)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到最佳提取工藝為飲片浸泡0.5 h，加9 倍量水，提取3 次，每次分別提取90，45，45 min。