索尼婭石斛多糖亞臨界水提取工藝優化研究*

王 娜，鄒愷平，劉 順，劉 煒△

（1. 南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029； 2. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

石斛為蘭科石斛屬DendrobiumSw. 植物，其新鮮或干燥莖常被收作藥用。《神農本草經》將石斛列為上品，具有滋陰清熱、抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力等作用［1-2］。多糖類成分是石斛屬植物的主要成分，具有促進免疫和抗腫瘤作用［3-5］，常以多糖含量的高低來判斷石斛藥材質量的優劣［6］。目前，國產石斛屬植物由于生長環境特殊、生長周期長、年生長量有限、有性繁殖困難等因素，產量已遠不能滿足中藥石斛藥材及復方制劑生產的原料供應［7］。同時，石斛藥食同源，人們在廣泛使用過程中往往會忽略其潛在的毒副作用［8］。索尼婭石斛Dendrobium Sonia作為蘭科石斛屬人工培育品系，具有開花時間長、花多、枝長、采后保鮮期長等特點，但目前對其藥用價值和安全性的研究非常有限。前期研究中發現，索尼婭石斛多糖（DSP）具有很好的免疫調節活性［9］。本研究中為了獲得高效的DSP 提取方法，優化了亞臨界水提取工藝［10-13］，以期為DSP 成藥性提供理論基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AF - 16A 型粉碎機（溫嶺市奧力中藥機械有限公司）；BP-211D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為十萬分之一）；AX224ZH/E 型水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；FreeZone. 2.5 型凍干機（美國Labconco 公司）；Evolution 201 型紫外分光光度計（美國Thermo Fisher 公司）；亞臨界萃取機由南京林業大學提供；Direct-Q3型超純水機（德國Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

索尼婭石斛干燥莖（南京金陵藥業股份有限公司，批號為20151103）；石油醚（60～90 ℃分析純，成都市科龍化工試劑廠）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；濃鹽酸（分析純，上海久億化學試劑有限公司）；濃硫酸、固體氫氧化鈉，均為分析純，購于南京化學試劑股份有限公司；苯酚（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；D（+）-無水葡萄糖對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為S08J6G1，純度≥98%）；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 提取方法

藥材前處理：將索尼婭石斛干燥莖粉碎成粗粉，加6 倍量石油醚，浸泡2 h 脫脂后濾過，室溫放置樣品殘渣，揮干溶劑后置4 ℃冰箱，備用。

常規回流提取：稱取藥材前處理項下樣品殘渣100 g，加20倍量溶劑進行水提取（超純水）、酸提取（0.2 mol/L鹽酸）和堿提取（0.2 mol/L 氫氧化鈉），100 ℃加熱回流3 h，濾過。

亞臨界水提取：稱取藥材前處理項下樣品殘渣100 g，加20 倍量超純水進行亞臨界水提取（壓力為1.4 MPa，溫度為140 ℃），濾過。

2.2 多糖制備

取常規回流提取和亞臨界水提取項下濾液，調pH至6～7，加無水乙醇至醇濃度為80%，醇沉48 h，棄去溶劑得多糖沉淀，加水溶解，凍干（壓力為3.0 Pa，溫度為-40 ℃），即得多糖凍干粉末。

2.3 多糖含量與提取率測定

硫酸- 苯酚比色法測定多糖含量［14］：取葡萄糖對照品25.0 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加超純水溶解并定容，搖勻，即得葡萄糖對照品貯備液（質量濃度為1.0 mg/mL）。分別精密吸取0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL葡萄糖對照品貯備液，置10 mL 容量瓶中，加超純水定容，搖勻，即得質量濃度分別為50，100，150，200，250，300 μg/ mL 的系列葡萄糖對照品溶液。分別精密量取各質量濃度葡萄糖對照品溶液200 μL（空白樣品以等量超純水代替），置10 mL具塞試管中，分別加入超純水800 μL、5%苯酚溶液1 mL，沿試管壁迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩，搖勻，室溫下靜置20 min 至冷卻。于490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 0.007 6X+ 0.128 2（r= 0.998 8，n= 6）。結果表明，葡萄糖對照品質量濃度在50～300 μg/ mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

多糖提取率測定：收集各提取條件下多糖凍干粉末，分別溶解并定容至相同體積，即得多糖樣品溶液。采用硫酸-苯酚比色法［15］測定，按公式計算多糖提取率。多糖提取率（%）=（多糖濃度×提取液體積）/100×100%。由圖1 可知，亞臨界水提取法的DSP 提取率高于水提取多糖法。

圖1 不同提取方法的索尼婭石斛多糖提取率Fig.1 Comparison of extraction rates of Dendrobium Sonia with different extraction methods

2.4 DSP 亞臨界水提取工藝優化

2.4.1 單因素試驗

稱取藥材前處理項下樣品殘渣，分別考察不同提取溫度、液料比和提取壓力下的多糖提取率。由圖2可知，多糖提取率與提取溫度、液料比、提取壓力呈正相關；當液料比大于30 mL / g 時，提取率升高趨于平緩。

2.4.2 Box-Behnken 響應面試驗

因素與水平：根據單因素試驗結果和Box-Behnken響應面試驗設計原理，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取壓力（C）為考察因素。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

試驗設計與結果：稱取藥材前處理項下樣品殘渣10 g，共17份，按表1 進行試驗，按2.3 項下方法測定多糖提取率。試驗設計與結果見表2，擬合回歸方程的方差分析結果見表3，三維響應面圖見圖3。

表2 Box-Behnken響應面試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the Box - Behnken response surface test

表3 Box-Behnken響應面擬合回歸方程的方差分析結果Tab.3 Results of the analysis of variance of the Box-Behnken response surface fitting regression equation

A. 提取溫度與液料比 B. 提取溫度與提取壓力 C. 液料比與提取壓力圖3 各因素交互作用對索尼婭石槲多糖提取率影響的Box-Behnken三維響應面圖A.Extraction temperature and liquid - to - material ratio B.Extraction temperature and extraction pressure C.Liquid - to - material ratio and extraction pressureFig.3 Three dimensional response diagram of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides fromDendrobium Sonia

結果分析：由表3可知，運用亞臨界水提取模型分析各因素對提取工藝的影響合理（F=31.22，P＜0.000 1）。在本試驗選擇區域范圍內，提取溫度及液料比和提取時間的交互作用對多糖提取率均有極顯著影響（P＜0.01）。所得數據采用Design- Expert 8.0.6 軟件進行分析，各因素經回歸擬合后得回歸方程Y= 6.09 + 0.33A-0.069B+0.19C-0.36AB+0.16AC+0.27BC-0.41A2-0.59B2-0.72C2。根據所得模型，對響應面結果進行優化分析，可預測在穩定狀態下的最大值Y為6.19%；以多糖提取率為評價指標，提取工藝優化條件為提取溫度145 ℃、液料比25（mL/g）、提取壓力1.4 MPa。

2.5 驗證試驗

按最佳提取工藝條件，經3 批樣品驗證，多糖提取率分別為6.03%，6.14%，6.09%。結果表明，該提取工藝穩定、可靠。

3 討論

本研究中曾選擇不同水提取方法提取DSP，但提取率均不理想。參考文獻［16-17］，發現亞臨界水提取法的提取率遠高于傳統水提取法，且成本低、環保，故采用亞臨界水提取法進行試驗。推測是由于試驗中隨著溫度的上升，水的介電常數降低，DSP 在水中的溶解度及物質傳質系數提高，提高了DSP 的擴散速率［18］。以DSP提取率為評價指標，選擇提取率較高的亞臨界水提取法，利用Box-Behnken 響應面試驗考察提取溫度、液料比、提取壓力對DSP 提取率的影響。結果表明，最佳提取工藝條件為提取溫度145 ℃，液料比25（mL/g），提取壓力1.4 MPa。該工藝穩定、可靠，可為工業化大生產的DSP提取提供參考。