基于電子順磁共振技術對茶油抗氧化活性的研究

郭浩彬　張陸燕　李敏杰　黃天琪　章銀良　趙宇　張麗

摘要：運用電子順磁共振波譜儀探究不同抗氧化劑對茶油自由基的影響，結果表明，隨著溫度的升高或反應時間的延長，茶油產生自由基的總量和種類不斷增加。通過測量茶油的過氧化值、烷基自由基、烷過氧自由基，可得出TBHQ、BHA、BHT、Vc對茶油均具有保護作用，TBHQ對茶油的保護效果最佳。茶油對不同自由基均具有清除效果，對DPPH自由基的清除率為41.89%，對羥基自由基的清除率為56.31%，對羧基自由基的清除率為26.20%。

關鍵詞：電子順磁共振波譜技術；茶油；自由基；抗氧化劑

中圖分類號：TS255.1文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0066-05

Abstract： The effect of different antioxidants on the free radicals of camellia oil is investigated by electron paramagnetic resonance spectrometer. The results show that with the increase of temperature or the extension of reaction time， the total amount and types of free radicals produced by camellia oil increase continuously. By measuring the peroxide value， alkyl radical and alkane peroxy radical of camellia oil， it can be concluded that TBHQ， BHA， BHT and Vc all have protection effects on camellia oil， and TBHQ has the best protection effect. Camellia oil has scavenging effects on different free radicals. The scavenging rates on DPPH free radical， hydroxyl free radical and carboxyl free radical are 41.89%， 56.31% and 26.20% respectively.

Key words： electron paramagnetic resonance spectroscopy technology; camellia oil; free radical; antioxidant

收稿日期：2022-12-20

基金項目：河南省科技攻關項目（182102110094）

作者簡介：郭浩彬（1998—），男，碩士，研究方向：食品科學與品質安全。

*通信作者：章銀良（1963—），男，教授，博士，研究方向：食品科學與品質安全。

茶籽油亦稱山茶油，是從山茶科（Camellia）油茶樹的種籽中提煉而得，有“東方橄欖油”之稱，被公認為是世界上最好的植物油之一。茶油中含有多種營養成分，如茶多酚、角鯊烯、亞油酸、共軛亞油酸、茶皂素等，對人體具有較高的營養價值[1]。茶多酚的抗氧化性較強，可以預防心血管、癌癥等疾病，且具有廣譜的抗菌殺毒作用，可有效抑制蠟樣芽孢桿菌菌膜形成[2-3]。角鯊烯最初在鯊魚肝油中發現，后在茶油中也有發現。角鯊烯具有較強的抗氧化能力，可抑制DNA的氧化損傷[4]。亞油酸具有一定的抗氧化性，可有效清除DPPH自由基和ABTS+自由基[5]，共軛亞油酸不僅對腫瘤細胞具有抑制作用[6]，還可提高免疫機能和抗氧化功能[7]。茶皂素可改變細胞膜通透性，破壞細胞膜結構，抑制細菌生長，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌效果[8]。

自由基外層軌道含有不成對電子，有較強的反應活性，環境和內部代謝產生的自由基會對細胞造成損害，攻擊細胞內的蛋白質、脂質等物質，導致氧化損傷，進而造成人體功能的損害[9]。而食品中的自由基是食品在發生氧化時形成的，會引起食品變質，降低產品質量并縮短食品的貨架期。茶籽油在處理過程中容易發生氧化，其中自由基引發的自動氧化是主要原因之一[10]。抑制自由基的產生對于保證茶籽油的質量及延長茶籽油的貨架期具有重要意義。

抗氧化劑是重要的食品添加劑，可抑制食品中脂質和蛋白質等成分的氧化變質，延長食品的貨架期，目前在食品加工中已廣泛應用[11]。蔣緯等[12]發現茶多酚、BHT、TBHQ 3種抗氧化劑均可有效抑制紫蘇籽在儲藏過程中的氧化。燕守鑫等[13]發現在花椒籽油中單獨添加BHT、TBHQ、PG 3種抗氧化劑以及添加混合抗氧化劑均可有效抑制花椒籽油的氧化變質，POV值顯著低于空白組。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技術是一種能夠快速、簡單、直接檢測和研究具有未成對電子的化合物的現代分析方法[14]。傳統的化學指標和氧化有害產物分析并不能對脂質早期氧化所產生的自由基進行研究，而電子自旋共振技術可對脂質氧化反應早期（未生成初級氧化產物時）產生的含未成對電子的少數自由基進行定性和定量分析[15]。因此，本文利用電子自旋共振技術分析茶油對不同自由基的體外清除效果，以及不同加熱條件下不同抗氧化劑對茶油氧化過程中生成的自由基的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

茶油：產自湖南省株洲市（未添加抗氧化劑，壓榨時間2021年10月，實驗時間2022年3月）。

1.2 試劑

石油醚、冰乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、二甲基亞砜：均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；可溶性淀粉、無水乙醇：均為分析純，天津市永大化學試劑有限公司；氯甲烷、鹽酸：均為分析純，煙臺市雙雙化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基、丁基羥基茴香醚、叔丁基對苯二酚、維生素C、N-叔丁基-α-苯基硝酮、硫代硫酸鈉、碘化鉀、5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器與設備

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；E-scan Bruker電子順磁共振波譜儀 美國布魯克科技（北京）有限公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數顯恒溫油浴槽、HH-S水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DH-400A電熱恒溫培養箱 北京中興偉業儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 茶油抗氧化活性的測定

DPPH·清除能力的測定：參考章銀良等[16]的方法，以無水乙醇作為溶劑，配制0.5 mmol/L的DPPH溶液，取100 μL茶油與400 μL DPPH溶液混勻，暗反應20 min后，用毛細管虹吸23.77 μL樣品，運用ESR測量DPPH譜圖并記錄二重積分值為As，空白組用無水乙醇替代茶油，按上述方式測量譜圖并記錄其二重積分值為Ac。

羧基自由基清除能力的測定：參考Tong等[17]的方法，制備磁性Fe3O4/MoS2 納米復合材料。取20 mg復合材料、500 μL H2O2（30%）溶于20 mL DMSO中，磁力攪拌后用0.22 μm尼龍膜過濾，于2.5 mL離心管中依次加入20 μL DMPO、800 μL過濾樣品液、500 μL茶油并用渦旋儀振蕩30 s。用毛細管虹吸23.77 μL樣品，5 min后開始測量，將羧基自由基的ESR譜圖的二重積分值記錄為As，空白組用等量DMSO代替茶油，其余操作一致，其二重積分值記錄為Ac。

羥基自由基清除能力的測定：采用芬頓反應[18]，于2.5 mL離心管中依次加入20 μL DMPO、420 μL去離子水、20 μL 5 mmol/L FeSO4、400 μL茶油，隨后添加20 μL 50 mmol/L H2O2并用渦旋儀振蕩40 s并計時，反應3 min后開始測量，將羥基自由基的ESR譜圖的二重積分值記錄為As，空白組用等量去離子水代替茶油，其余操作一致，其二重積分值記錄為Ac。

自由基清除率（%）=Ac－AsAc×100%。

式中：Ac為空白組的二重積分值，As為對照組的二重積分值，上述3種自由基清除率計算公式一致。

1.4.2 抗氧化劑待測樣品的配制

取20 g茶油置于錐形瓶中，按照GB 2760－2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中的規定加入0.02%的BHA、TBHQ、BHT、Vc，超聲（時間5 min、功率70 W）溶解后備用。

1.4.3 自由基的測定

1.4.3.1 自由基總量的測定

溫度組：在1 mL茶油樣品中加入15 mg PBN捕獲劑并超聲（時間5 min、功率70 W）溶解后，用10 mL的注射器將其注射進核磁管，甩至底部。將其分別置于60，80，100，120，140 ℃的油浴鍋中，加熱3 min后迅速取出，冷水沖涼并擦拭干凈后置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測定ESR強度（用二重積分表示自由基總量）。

時間組：在1 mL茶油樣品及抗氧化劑待測樣品中加入15 mg PBN捕獲劑，將其置于100 ℃的油浴鍋中，每隔2 min迅速取出，其余操作同上，測自由基總量。

儀器測定條件：中心磁場3 487 G；掃描寬度100 G；微波頻率9.798 615 GHz；微波功率5 mW；調制幅度1.01 G；調制頻率86 kHz；保留時間20.48 s；掃描次數4次。

1.4.3.2 不同自由基種類及含量的測定

向1 mL加入不同抗氧化劑的茶油油樣及未加入抗氧化劑的茶油樣品中加入50 μL DMPO后超聲5 min，溶解后，用10 mL的注射器將其注射進核磁管，甩至底部。將其置于120 ℃的油浴鍋中，每隔1 min迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測定ESR強度（用二重積分表示）。

儀器測定條件：中心磁場3 487 G；掃描寬度100 G；微波頻率9.831 712 GHz；微波功率5 mW；調制幅度2.27 G；調制頻率100 kHz；保留時間40.96 s；掃描次數4次。

1.4.4 茶油品質指標的測定

采用Schaal烘箱加速氧化試驗研究茶油的氧化穩定性，取100 g油樣，放入錐形瓶中。將抗氧化劑待測油樣和茶油樣品置于（60±1） ℃的恒溫培養箱內避光保存，每隔1 d 取樣1次，測定油樣的過氧化值（POV），過氧化值測定參照 GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的滴定法。

1.4.5 統計分析

所有試驗均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Simfonia、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關方法進行處理，并用SPSS軟件進行顯著性分析（P<0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 茶油抗氧化活性測定結果

茶油對DPPH自由基、羥基自由基、羧基自由基的清除效果見圖1。

茶油中含有大量的茶多酚、維生素E、醌類、類胡蘿卜素等具有抗氧化活性的物質，因此茶油本身亦具有較強的抗氧化活性[19-20]。由圖1可知，茶油對上述3種自由基均具有較強的清除效果，對DPPH自由基的清除率為41.89%，對羥基自由基的清除率為56.31%，對羧基自由基的清除率為26.20%。DPPH·和OOH·所使用的溶劑能和茶油互溶，因此可以很好地作為衡量茶油抗氧化活性的指標，而芬頓反應是以H2O作為反應溶劑，因此實際操作過程中可采取渦旋振蕩后除去上層液或添加乳化劑的形式進行操作。

2.2 不同抗氧化劑對茶油自由基總量的抑制結果

由圖2中A可知，隨著加熱時間的延長，脂肪側鏈、含氧官能團等不斷發生裂解[21]，導致自由基不斷生成，抗氧化劑的加入可以抑制這一過程。不同抗氧化劑對茶油總自由基的抑制作用由強到弱為TBHQ＞BHT＞BHA，而Vc反而使得自由基總量較空白組有所提高，原因可能是茶油在與氧氣接觸后因高溫誘導產生自由基和過氧化物，其中的過氧化物水解或催化會解離生成過氧化氫[22]，而Vc會催化過氧化氫反應，生成大量的羥基自由基[23]。

PBN捕獲的油的ESR譜圖常用于表示油脂氧化生成的自由基的相對定量研究[24]，由圖2中B可知，其譜圖的二重積分或利用峰高可表示為氧化前期自由基生成的總量[15]，PBN捕獲的油脂自由基由N核和H核環境構成，升高溫度和延長反應時間會使茶油氧化更迅速，導致自由基總量不斷增加，油的黏性會導致ESR譜圖和擬合曲線有所差距（第3個主峰）。

2.3 不同抗氧化劑對茶油不同種類自由基的抑制結果

不同加速氧化的溫度會影響產生自由基的種類[25]，由圖3可知，在100 ℃加速氧化過程中，DMPO捕獲茶油自由基的種類為烷基自由基（R·）、烷過氧自由基（ROO·）、DMPO氧化產生的自由基（DMPO-X），在此加速氧化過程中并未捕獲到烷氧自由基（RO·）這可能與加熱的條件和儀器的靈敏度相關[26]，在此氧化條件下，茶油中自由基含量最高的為R·，其次為DMPO氧化產生的DMPO-X，而ROO·含量最少。不同抗氧化劑對茶油中不同種類的自由基抑制效果不一致，升高溫度會促使ROO·的生成，具體影響結果見圖4～圖6。

由圖4可知，不同種類的抗氧化劑對茶油的烷基自由基均具有抑制作用，抑制效果由強到弱為TBHQ＞BHT＞VC＞BHA，烷基自由基隨加熱時間的延長呈現出先增后減的趨勢，烷基自由基的增長是由于升溫促使茶油不斷氧化，導致烷基自由基不斷積累。而烷基自由基的減少可能存在兩種原因：其一，DMPO自身不穩定[15]，隨著加熱時間的延長，DMPO被氧化，導致補集效果減弱；其二，加熱可以加速自由基鏈式反應[27]，導致烷基自由基轉變成烷氧自由基。由圖5可知，DMPO自身穩定性較差，在加熱條件下會出現開環，形成DMPO-X，導致DMPO捕獲效果減弱。由圖6可知，不同抗氧化劑對烷過氧自由基的抑制效果顯著，其抑制效果主要體現在可以抑制ROO·的強度，以及抑制烷過氧自由基產生的時間，不同抗氧化劑抑制烷過氧自由基的能力由強到弱為TBHQ＞VC＞BHA＞BHT。綜上所述，TBHQ對茶油產生的烷基自由基和烷過氧自由基的抑制能力最強，這可能是由于TBHQ能有效削弱茶油自由基的鏈式反應，但同時加入TBHQ的茶油組產生的DMPO-X自由基信號強度也最強，這一原因有待進一步研究。

2.4 不同抗氧化劑對茶油過氧化值的影響

上述研究中，TBHQ對茶油的烷基自由基和烷過氧自由基的抑制效果最強，但與此同時DMPO-X的信號強度高于空白組，為進一步研究上述抗氧化劑對茶油的抗氧化效果，通過加速氧化，以POV值為指標，進行不同抗氧化劑對茶油過氧化值影響的研究，結果見圖7。

由圖7可知，該茶油的初始過氧化值＞0.25 g/100 g，高于湖南茶油A級標準（T/HNYC 001－2019），這主要是儲存時間過長所致。熱處理可以加速油脂氧化，使油脂中過氧化值升高[28]。隨著加速氧化過程的進行，茶油氧化程度不斷加深，導致過氧化物的含量不斷增加，抗氧化劑對茶油中過氧化物具有明顯的抑制效果。抑制效果由強到弱為TBHQ＞BHA＞BHT＞VC。綜上可知，TBHQ對茶油的抗氧化效果最佳，TBHQ可通過抑制烷基自由基和烷過氧自由基的生成，阻斷自由基的鏈式反應，以減少過氧化物的產生，提高茶油的抗氧化性能。

3 結論

茶油中含有抗氧化活性物質，對DPPH自由基、羧基自由基、羥基自由基均具有清除效果。運用電子順磁共振波譜技術研究茶油加速氧化過程，結果表明不同抗氧化劑對茶油氧化過程中抑制自由基的程度與抑制過氧化物的生成情況結果接近，因此電子順磁共振波譜技術可以作為增強茶油氧化前期穩定性的方法。

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