彈性蛋白肽的制備工藝優化及其理化性質分析

李清嵐　劉穎　崔春

摘要：采用牛動脈彈性蛋白為原料，以彈性蛋白酶抑制活性和蛋白回收率為評價指標，研究彈性蛋白肽制備工藝和理化性質。結果表明，胰酶在酶添加量1.0%、pH 11、溫度45 ℃和時間15 h的條件下酶解彈性蛋白，彈性蛋白酶抑制活性（蛋白濃度為10 mg/mL）為35.63%，蛋白回收率可達80.08%；彈性蛋白酶解過程中，部分β-折疊和α-螺旋轉化為β-轉角，酶解產物小于1 000 Da的肽段占45.50%，富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，具有較強還原力，清除DPPH和ABTS自由基的IC50值分別為6.90，3.41 mg/mL，且在溫度＜85 ℃、pH為中性和堿性的條件下具有良好的穩定性。

關鍵詞：彈性蛋白；胰酶；MMP-12抑制活性；蛋白回收率；理化性質

中圖分類號：TS201.2文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0189-06

Abstract： With bovine arterial elastin as the raw material， elastase inhibitory activity and protein recovery rate as the evaluation indexes， the preparation process and physicochemical properties of elastin peptides are studied. The results show that when elastin is hydrolyzed by pancreatin under the conditions of enzyme addition amount of 1.0%， pH of 11， temperature of 45 ℃ and time of 15 h， the elastase inhibitory activity （protein concentration of 10 mg/mL） is 35.63% and the protein recovery rate is 80.08%. During the enzymolysis of elastin， some β-folding and α-helix are converted into β-turn. In the enzymatic hydrolysate， the peptides less than 1 000 Da account for 45.50%， which are rich in hydrophobic amino acids and aromatic amino acids， have strong reducing capacity， and the IC50 of scavenging DPPH and ABTS radicals is 6.90， 3.41 mg/mL respectively， and they have good stability at temperature < 85 ℃， pH neutral and alkaline conditions.

Key words： elastin; pancreatin; MMP-12 inhibitory activity; protein recovery rate; physicochemical properties

收稿日期：2022-12-05

基金項目：國家自然科學基金項目（31201416）；國家重點研發計劃項目（2016YFD0400803）

作者簡介：李清嵐（1997—），女，碩士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）過度表達時會加速降解彈性蛋白、膠原蛋白等細胞外基質成分，表現為皮膚松弛、失去彈性、皺紋加深[1-3]。彈性蛋白酶（MMP-12）是降解彈性蛋白的關鍵酶[4]，且能激活其他MMPs活性[5]，與皮膚衰老密切相關，因此MMP-12抑制活性被認為是延緩皮膚衰老的潛在解決方案。彈性蛋白肽（elastin peptide，EP）是彈性蛋白原的降解產物，與MMP-12有良好的親和力[6]，調控彈性蛋白和膠原蛋白的mRNA表達[7-8]，增殖成纖維細胞并促進細胞外基質成分的合成[9-10]，因此通過生物酶解技術制備EP具有良好的開發價值。

彈性蛋白是一種硬蛋白，主要存在于牛、豬等哺乳動物的韌帶（約80%）、主動脈（30%～50%）、肺（10%～25%）、皮膚（2%～3%）或魚類的動脈球。丁劉剛等[11]以牛頸韌帶為原料，利用多種酶的協同作用在pH 7、50～60 ℃酶解10～20 h，制備具有美容作用的EP。蔡亞君等[12]采用木瓜蛋白酶在pH 6～8、30～60 ℃下酶解豬蹄粉10～20 h，制備可改善睡眠的EP。劉洋[13]、Nakaba等[14]分別以牛動脈、魚動脈球制備具有抗皮膚衰老活性的EP。目前國內外對EP的研究多集中在活性評價，鮮有提及EP回收率，相關制備工藝的基礎性研究也較少。然而，在實際生產中酶解效率對于原料利用和經濟效益具有重要意義。隨著市場對彈性蛋白肽需求的與日俱增，尋求效率高、成本低、效果顯著的制備工藝亟待解決。本研究通過酶篩選和工藝優化提高彈性蛋白的酶解效率，探討彈性蛋白肽的理化性質，以期為制定科學的生產工藝提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛動脈：購于當地市場；彈性蛋白酶、N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA：Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；其他無機試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

L-8800氨基酸分析儀 安捷倫科技有限公司；U-3000液相色譜儀、Multiskan Sky多功能酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 彈性蛋白的提取

新鮮牛動脈清洗后去除表面脂肪，絞碎。采用熱堿法[15]提取，去除表面油脂和可溶性雜蛋白。將牛動脈與0.1 mol/L NaOH按1∶10（質量和體積比）混勻，95 ℃水浴振蕩1 h，水洗至中性，離心取沉淀凍干，儲存使用。

1.3.2 酶種類篩選

按照表1的水解條件，稱取2 g彈性蛋白粉，加20 g水復溶，調節pH，酶底比（E/S）為1.0%，在一定溫度下酶解15 h后沸水浴滅酶10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定MMP-12抑制活性、蛋白回收率和水解度。

1.3.3 彈性蛋白酶解工藝優化

1.3.3.1 單因素試驗

選用胰酶對彈性蛋白酶解，通過對酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）、酶解時間（9，12，15，18，21，24 h）、酶解pH（6，7，8，9，10，11）進行研究，優化MMP-12抑制肽制備工藝。

1.3.3.2 正交試驗

采用L9（33）正交表（見表2），選取酶解溫度、酶解時間和酶解pH 3個考察因素，以MMP-12抑制活性和蛋白回收率為評價指標，確定最優酶解工藝條件。

1.3.4 蛋白回收率和水解度的測定

采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定總氮，水解度采用甲醛滴定法測定。

水解度（%）=上清液氨基酸態氮含量原料總氮含量×100。

蛋白回收率（%）=上清液總氮質量原料總氮質量×100。

1.3.5 MMP-12抑制活性的測定

根據劉洋[13]的方法并稍作修改，96孔板依次加入200 μL樣品和50 μL 彈性蛋白酶（60 mU/mL），充分混勻，于25 ℃放置3 min，隨后加入50 μL N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA（1 mmol/L），在410 nm處測定吸光度，記為Ac0、As0，將板放在全波長掃描儀上于25 ℃溫育10 min，隨后立即在410 nm處測定反應后的吸光度，記為Ac、As。以Tris-HCl 緩沖液作為對照。MMP-12抑制活性計算公式如下：

MMP-12抑制活性（%）=1－As－As0Ac－Ac0×100。

式中：As0為反應前樣品組的吸光度，As為反應后樣品組的吸光度；Ac0為反應前對照組的吸光度，Ac為反應后對照組的吸光度。

1.3.6 彈性蛋白和EP的理化性質測定

1.3.6.1 紅外光譜分析

采用紅外光譜（FT-IR）法測定蛋白結構，稱取20 mg樣品，溴化鉀混合壓片，波長掃描范圍設置為400～4 000 cm-1，FT-IR光譜和二級結構采用Ominic和PeakFit軟件進行分析。

1.3.6.2 氨基酸組成的測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》測定氨基酸組成。

1.3.6.3 肽分子量的測定

采用HPLC法測定分子量分布，色譜柱：TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm，250 mm），檢測波長220 nm，柱溫30 ℃。流動相為水∶乙腈為80∶20（體積比），加入濃度為0.1%的TFA，以0.5 mL/min等度洗脫。以標準品分子量對數與保留時間作圖得標準曲線，計算分子量分布。

1.3.6.4 抗氧化活性的測定

根據葉昱輝[16]的方法測定還原力。

根據GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測定 DPPH和ABTS法》測定。

1.3.6.5 溫度和pH對EP活性保留率的測定

配制質量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，分為溫度組（25，45，65，85，100，121 ℃保溫2 h）和pH組（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0放置2 h后將pH調至8.0），分別將25 ℃和pH 8.0設為對照組（100%），計算MMP-12抑制活性保留率。

1.4 數據處理

試驗數據使用Excel和SPSS 23.0軟件統計分析，結果記為“平均值±標準偏差”，采用Tukey檢驗進行顯著性分析，P<0.05視為具有顯著性差異，使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酶種類篩選

不同蛋白酶的酶切位點不同，催化同一底物產生的肽鏈長度和氨基酸序列不同導致活性有差異。由表3可知，采用堿性蛋白酶、AB 8000、木瓜蛋白酶酶解的EP的MMP-12抑制活性顯著高于其他蛋白酶，NS 37071、胰酶酶解的EP次之，但堿性蛋白酶、AB 8000、木瓜蛋白酶酶解的蛋白回收率和水解度很低，表明彈性蛋白未充分水解，造成總體活性貢獻率低和原料的浪費。NS 37071與胰酶酶解的EP的MMP-12抑制活性無顯著性差異，但胰酶酶解的EP蛋白回收率是NS 37071的1.48倍，顯著高于NS 37071。胰酶中蛋白酶主要由胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶等組成，姜佳等[17]利用胰蛋白酶和胰糜蛋白酶協同酶解豬肺可獲得高鎖鏈素含量的彈性蛋白肽，說明胰蛋白酶和胰糜蛋白酶能提高彈性蛋白肽的釋放量，此外，彈性蛋白酶對彈性蛋白具有特異吸附性，對彈性蛋白優先水解且有很強的水解作用[18]，這可能是胰酶能深度水解結構穩定的彈性蛋白的原因。綜合考慮活性和得率，選擇胰酶進一步試驗。

由圖1可知，當蛋白濃度小于50 mg/mL時，隨著EP濃度的增大，MMP-12抑制活性隨之提高，表明EP的MMP-12抑制活性與蛋白濃度存在良好的劑量關系，因此EP的蛋白回收率越大，對產品整體的貢獻率越大。

2.2 單因素試驗結果

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，MMP-12抑制活性呈現倒“V”趨勢，在45 ℃時MMP-12抑制活性、蛋白回收率達到最大值，因此45 ℃為最佳酶解溫度。隨著酶添加量的增加，MMP-12抑制活性無顯著性差異，說明在不同酶添加量下可能得到相似組成的EP。當酶添加量在0.5%～1.0%時，蛋白回收率增加幅度較大，當酶添加量>1.0%時，蛋白回收率增加緩慢。綜合考慮生產成本，確定酶添加量為1.0%。隨著酶解時間的延長，蛋白回收率隨之增大，在15 h后增加幅度變緩，MMP-12抑制活性在12 h后無顯著性差異，這與劉洋[13]的研究結果相似，因此選擇9～15 h進一步優化。pH在8～11范圍內MMP-12抑制活性無顯著性差異，且在pH 10時達到最高蛋白回收率，過高的pH（＞12）會導致胰酶失活，因此選擇pH 9～11進一步優化。

2.3 正交試驗結果

由表4中極差分析可知，影響蛋白回收率和MMP-12抑制活性的主次順序均為時間＞pH＞溫度。對于因素A和因素C，蛋白回收率和MMP-12抑制活性的最優水平分別為A2和C3。對于因素B，優化水平可選B2或B3。取B2時，MMP-12抑制活性比取B3時提高10.3%，蛋白回收率減少6.4%，故因素B取B2。因此，本試驗的優化組合為A2B2C3，即酶解溫度為45 ℃，酶解時間為15 h，酶解pH為11。在該條件下酶解，蛋白回收率為80.08%，水解度為12.98%，蛋白濃度為10 mg/mL時MMP-12抑制活性為35.63%。

2.4 彈性蛋白和EP的紅外光譜分析

酶解前后彈性蛋白在4 000～500 cm-1范圍內的FT-IR光譜見圖3。

3 500～3 100 cm-1區域強而寬的特征峰是由O-H和N-H伸縮振動引起的，吸收峰紅移，說明形成氫鍵，可能是由于N-H伸縮振動與氫鍵互相結合[19]。1 700～1 600 cm-1為酰胺I帶，此波段的吸收峰表示蛋白分子間以及分子內部形成的二級結構。一般而言，酰胺I帶吸收的波數越低，蛋白質中的氫鍵作用越高，酶解后的酰胺I帶（CO伸縮振動峰）發生了藍移（約8 cm-1），可能是酶解處理破壞了彈性蛋白結構中CO參與的氫鍵作用，從而引起蛋白螺旋結構的部分解體[20]，表明其二級結構發生變化。

由表5可知，在酶解過程彈性蛋白的二級結構之間出現了相互轉化。β-折疊從49.45%降低到32.12%，α-螺旋從15.27%降低到9.65%，無規則卷曲無顯著性變化，β-轉角從13.36%增加到32.09%，β-反平行從1.40%增加至5.04%。β-折疊結構變化較復雜，包括分子內、分子間平行和反向平行等多種形式，其中平行β-折疊較β-反平行折疊更規則。彈性蛋白的重復序列具有較高的形成分子內和分子間氫鍵的能力，這與β-折疊形成有關，由表5可知，彈性蛋白的β-折疊含量高達49.45%，這可能與彈性蛋白特殊的氨基酸組成有關，且β-折疊相較于α-螺旋、β-轉角更穩定[21]，α-螺旋、β-折疊的減少和β-轉角的增加可能使蛋白質展開，二級結構由有序轉為無序，利于酶解的進行，使得更多的疏水性氨基酸暴露。

2.5 彈性蛋白和EP的氨基酸組成

彈性蛋白和EP具有相似的氨基酸組成和含量，彈性蛋白（肽）的標志性氨基酸（Des和Ide）含量約為0.18%，非極性氨基酸占比超過90%，Gly含量高達24%，Ala含量約占19%；親水性氨基酸含量較低，其中Met含量極少（未檢出），與報道的（牛來源）彈性蛋白氨基酸組成相符[22]。EP高水平的Gly、Ala、Val、Pro、Leu、Phe被報道與彈性蛋白酶具有良好的親和力[23]，這可能是其具有較高MMP-12抑制活性的原因。彈性蛋白酶解后，堿性氨基酸Lys、Arg、His和酸性氨基酸Asp含量增加，芳香族氨基酸Phe和Tyr含量占比約為10%，高含量的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸可能對EP的抗氧化活性起著關鍵作用。

2.6 EP的肽分子量分布

由表7可知，EP的分子量小于3 000 Da的多肽組分占彈性蛋白肽的60.49%，其中小于1 000 Da的多肽占45.50%，據報道，小肽更容易被吸收利用且在體內發揮生物活性作用[24—25]。同時，蛋白過度酶解可能會因含有大量游離氨基酸而導致活性降低，Alemán等[26]研究發現酶解物中的游離氨基酸會降低其抗氧化活性，本研究中EP分子量小于180 Da的多肽占比僅為0.44%，含量極低，說明在該酶解條件下，彈性蛋白并未過度水解。

2.7 EP的抗氧化活性

彈性蛋白肽的抗氧化活性對延緩皮膚衰老有潛在貢獻作用[27—29]。

由圖4可知，隨著質量濃度的增加，EP的還原力、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力都逐漸增強。當質量濃度為8.0 mg/mL時，EP在700 nm處的吸光值為0.352，與0.1 mg/mL谷胱甘肽的還原力相當，具有較強的還原力。唐敏等[30]制備的牛頸韌帶EP在質量濃度30 mg/mL時，在700 nm處的吸光值不及0.3。經計算，EP的DPPH和ABTS自由基清除能力的IC50值分別為6.90，3.41 mg/mL。當EP的質量濃度分別約為GSH的25倍和38倍時，EP清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力與GSH相當。

2.8 溫度和pH對EP活性保留率的影響

熱處理和pH處理是食品加工中的常用方法，由圖5可知，升高溫度（＜65 ℃）對MMP-12抑制活性無顯著影響，當溫度升至85 ℃以上，MMP-12抑制活性低于85%。EP在不同pH條件下MMP-12抑制活性保留率呈現中間高兩端低的特點，在中性和偏堿性條件下MMP-12抑制活性保留率保持在85%以上。

3 結論

以牛動脈彈性蛋白為原料，通過酶篩選和工藝優化制備具有高蛋白回收率的MMP-12抑制肽，分析其二級結構、氨基酸組成、肽分子量分布、抗氧化能力和加工穩定性，對它們的理化性質進行基礎性研究，為EP的實際應用提供借鑒。

參考文獻：

[1]KIM H， JANG J， SONG M J， et al. Inhibition of matrix metalloproteinase expression by selective clearing of senescent dermal fibroblasts attenuates ultraviolet-induced photoaging[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2022，150：113034.

[2]DUAN Y， CHEN Y， LI Y R， et al. The effects of reactive oxygen species in the process of skin photoaging[J].Life Research，2022，5（2）：10.

[3]PILLAI S， ORESAJO C， HAYWARD J. Ultraviolet radiation and skin aging： roles of reactive oxygen species， inflammation and protease activation， and strategies for prevention of inflammation-induced matrix degradation-a review[J].International Journal of Cosmetic Science，2005，27（1）：17-34.

[4]VAN DOREN S R. Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin[J].Matrix Biology，2015，44-46：224-231.

[5]LIU M， SUN H J， WANG X F， et al. Association of increased expression of macrophage elastase （matrix metalloproteinase 12） with rheumatoid arthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2004，50（10）：3112-3117.

[6]VERMA R P， HANSCH C. Matrix metalloproteinases （MMPs）： chemical-biological functions and （Q）SARs[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2007，15（6）：2223-2268.

[7]LIU Y， SU G W， WANG S G， et al. A highly absorbable peptide GLPY derived from elastin protect fibroblasts against UV damage via suppressing Ca2+ influx and ameliorating the loss of collagen and elastin[J].Journal of Functional Foods，2019，61：103487.

[8]LIU Y， SU G W， ZHOU F B， et al. Protective effect of bovine elastin peptides against photoaging in mice and identification of novel antiphotoaging peptides[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66（41）：10760-10768.

[9]SHIRATSUCHI E， NAKABA M， YAMADA M. Elastin hydrolysate derived from fish enhances proliferation of human skin fibroblasts and elastin synthesis in human skin fibroblasts and improves the skin conditions[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2016，96（5）：1672-1677.

[10]SHIRATSUCHI E， NAKABA M， SHIGEMURA Y， et al. Fish-elastin Hydrolysate： Development and Impact on the Skin and Blood Vessels[M]//Marine Proteins and Peptides： Biological Activities and Applications， Hoboken： Wiley-Blackwell，2013：467-486.

[11]丁劉剛，梁明，郭曉蕾，等.一種彈性蛋白肽及其制備方法、應用：中國，106381323A[P].2017-02-08.

[12]蔡亞君，彭其安，王布勻，等.改善睡眠的彈性蛋白活性肽及其制備工藝：中國，112521490A[P].2021-03-19.

[13]劉洋.彈性蛋白肽的抗皮膚光老化功效及其作用機制研究[D].廣州：華南理工大學，2019.

[14]NAKABA M， OGAWA K， SEIKI M， et al. Properties of soluble elastin peptide from bulbus arteriosus in fish species[J].Fisheries Science，2006，72（6）：1322-1324.

[15]MECHAM R P. Methods in elastic tissue biology： elastin isolation and purification[J].Methods，2008，45（1）：32-41.

[16]葉昱輝.近江牡蠣多肽的分離純化及其抗氧化、抗光老化活性研究[D].廣州：華南理工大學，2018.

[17]姜佳，劉紅彥，劉漢民，等.一種彈性蛋白肽的制備方法：中國，111955592A[P].2020-11-20.

[18]詹莉.枯草芽孢桿菌彈性蛋白酶的純化及酶學性質的研究[D].雅安：四川農業大學，2008.

[19]劉麗莉，李丹，楊陳柳，等.牛骨膠原蛋白酶解工藝優化及結構特性分析[J].食品與機械，2017，33（7）：40-46.

[20]梁健華.超聲波輔助提取羅非魚皮膠原蛋白及其功能結構性質的研究[D].廣州：華南理工大學，2016.

[21]YONG Y H， YAMAGUCHI S， MATSUMURA Y. Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（16）：6034-6040.

[22]SHIRATSUCHI E， URA M， NAKABA M， et al. Elastin peptides prepared from piscine and mammalian elastic tissues inhibit collagen-induced platelet aggregation and stimulate migration and proliferation of human skin fibroblasts[J].Journal of Peptide Science，2010，16（11）：652-658.

[23]QIAN B， ZHAO X， YANG Y， et al. Antioxidant and anti-inflammatory peptide fraction from oyster soft tissue by enzymatic hydrolysis[J].Food Science & Nutrition，2020，8（7）：3947-3956.

[24]XU Q B， HONG H， WU J P， et al. Bioavailability of bioactive peptides derived from food proteins across the intestinal epithelial membrane： a review[J].Trends in Food Science & Technology，2019，86：399-411.

[25]AHMED T， SUN X H， UDENIGWE C C. Role of structural properties of bioactive peptides in their stability during simulated gastrointestinal digestion： a systematic review[J]. Trends in Food Science & Technology，2022，120：265-273.

[26]ALEMN A， GIMNEZ B， PREZ-SANTIN E， et al. Contribution of Leu and Hyp residues to antioxidant and ACE-inhibitory activities of peptide sequences isolated from squid gelatin hydrolysate[J].Food Chemistry，2011，125（2）：334-341.

[27]AMAKYE W K， YANG L， YAO M， et al. Skipjack （Katsuwonus pelamis） elastin hydrolysate-derived peptides attenuate UVA irradiation-induced cell damage in human HaCaT keratinocytes[J].Food Frontiers，2021，2（2）：184-194.

[28]謝麗平.具有抗氧化、抗衰老活性的多肽篩選、分離純化及結構鑒定[D].廣州：華南理工大學，2019.

[29]馬夢嬌.中華鱉肉抗氧化肽的制備及其抗衰老功能研究[D].無錫：江南大學，2020.

[30]唐敏，許文濤，羅云波，等.彈性蛋白特性及其多肽抗氧化活性研究[J].中國食品學報，2014，14（2）：55-59.