沙棘糖漿對(duì)幼齡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物止咳化痰與消食化滯的藥效學(xué)研究

石佳琦,梁國(guó)棟,王 娜,韓運(yùn)祺,王玥璇,朱秋夢(mèng),呂 瑋,張 昕,肖云峰

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110; 2.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司,內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心/內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

沙棘作為藥食同源植物,具有很高的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用價(jià)值[1-2]。沙棘糖漿是根據(jù)蒙古醫(yī)書《飲膳正要》中赤哈納(即沙棘)的方劑,以《蒙藥正典》中的“沙棘祛痰,融化血,治巴達(dá)干病”為依據(jù)[3],將沙棘果實(shí)壓榨成汁,經(jīng)提取、過濾、濃縮等一系列工藝后,再加入蔗糖漿進(jìn)行稀釋,制成以沙棘汁為原料的糖漿劑。具有止咳化痰、消食化滯等作用。有文獻(xiàn)表明,沙棘糖漿可抑制小兒呼吸道感染,緩解咳嗽,改善兒童功能型消化不良,療效顯著[4-5]。本研究根據(jù)沙棘糖漿的功能主治,采用幼齡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象,進(jìn)行了止咳祛痰、消食化滯方面的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量(95±10)g;KM小鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量(15±2)g;英國(guó)(Hartley)豚鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±10)g。SD大鼠、KM小鼠購(gòu)自斯貝福生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。英國(guó)(Hartley)豚鼠由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0008。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心潔凈區(qū)。動(dòng)物使用許可證編號(hào):SYXK(蒙)2020-0001。

1.2 藥物與部分試劑

沙棘糖漿(內(nèi)蒙古大唐,批號(hào)20825018)。小兒止咳糖漿(華潤(rùn)三九,批號(hào)2001031N);四磨湯口服液(湖南漢森,批號(hào)2004311)。檸檬酸(優(yōu)晟環(huán)保,批號(hào)20200706);烏拉坦(上海康拓,批號(hào)20201110);碳酸氫鈉(海興旭陽(yáng),批號(hào)20191008);酚酞(沈陽(yáng)金天源,批號(hào)20201116);中筋面粉(棗莊市內(nèi)豐,批號(hào)20210326);現(xiàn)磨熟黃豆粉(哈爾濱寶利,批號(hào)20210423);大崎魚松粉(東山縣海弘,批號(hào)20210526);Mouse GAS、MTL、Pepsin、Trypsin、α-amylase Elisa kit(泉州市睿信,批號(hào)20210522001);高純食用葡萄糖粉劑(廣西梧州,批號(hào)20210502);淀粉(菱花集團(tuán),批號(hào)20200724);食用級(jí)活性炭末(鈺洋家具專營(yíng)店,批號(hào)20200423)。

1.3 儀器

壓縮式霧化器(尚鈞醫(yī)療科技有限公司,型號(hào) NB60);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher,型號(hào)Multiskan MK3)。

1.4 主要試劑的配制

1.4.1 高熱量高蛋白飼料

將大崎魚松粉、現(xiàn)磨熟黃豆粉、中筋面粉、全脂高鈣奶粉按 1∶2∶1∶1 的比例混合,做成長(zhǎng)條狀,陰干即得。

1.4.2 營(yíng)養(yǎng)性半固體糊

取全脂高鈣奶粉18g、高純食用葡萄糖粉8g、淀粉8g和食用級(jí)活性炭末2g,稱定,置500mL燒杯中,加1%羧甲基纖維素鈉300mL攪拌均勻,即得。

1.5 沙棘糖漿對(duì)幼齡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物止咳化痰的作用

1.5.1 沙棘糖漿對(duì)幼齡豚鼠止咳效果的影響

取120只豚鼠,采用枸櫞酸引咳法[6],將咳嗽次數(shù)n<5次和n>50次及潛伏期T<10 s和T>360 s的豚鼠剔除。次日將篩選出的合格的100只豚鼠,♀♂各半,隨機(jī)分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低[1.45 g/kg(1.62 mL/kg)]、中[2.91 g/kg(3.23 mL/kg)]、高[5.82 g/kg(6.47 mL/kg)]劑量組5組。止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿5.6 mL/kg,空白組灌胃等體積飲用水,1次/d,給藥14 d。于末次給藥前禁食不禁水約8 h,末次給藥1 h后按預(yù)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)并記錄咳嗽潛伏期和5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5.2 沙棘糖漿對(duì)幼齡大鼠痰液排放量的影響

取100只SD大鼠,♀♂各半,隨機(jī)分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低[1.70 g/kg(1.89 mL/kg)]、中[3.40 g/kg(3.78 mL/kg)]、高[6.81 g/kg(7.56 mL/kg)]劑量組5組。灌胃給藥,止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿3.83 mL/kg,空白組灌胃等體積飲用水,1次/d,給藥14 d。參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 沙棘糖漿對(duì)幼齡小鼠氣管酚紅排泌量的影響

取KM小鼠120只,用氨水引咳法對(duì)小鼠進(jìn)行篩選,選用3 min內(nèi)發(fā)生咳嗽的小鼠作為實(shí)驗(yàn)小鼠。選取合格小鼠100只,♀♂各半,隨機(jī)分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低3.67 g/kg(4.09 mL/kg)、中7.36 g/kg(8.17 mL/kg)、高14.71 g/kg(16.35 mL/kg)劑量組5組。灌胃給藥。止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿5.20 mL/kg,空白組灌胃等體積生理鹽水,1次/d,給藥14 d。按照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 沙棘糖漿對(duì)幼齡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物消食化滯的作用

1.6.1 沙棘糖漿對(duì)幼齡動(dòng)物消食效果的影響

取120只KM小鼠,♀♂各半。動(dòng)物適應(yīng)期喂養(yǎng)結(jié)束后,隨機(jī)分為6組,每組20只,空白組飼喂常規(guī)飼料,其余鼠飼喂自制的高熱量高蛋白飼料,2 d～7d,加喂0.2 mL/10g的牛奶溶液,2次/d。食積后小鼠精神不佳,活動(dòng)量減弱,蜷縮扎堆,皮毛色變黃,食量減少,腹部腫脹,糞便呈棕黃色[9]。7 d后其余組別平均攝食量均低于空白組80 %,即造模成功。造模后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組,♀♂各半,分別為空白組、模型組、四磨湯組(3.83mL/kg)、沙棘糖漿低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]劑量組。模型組、空白組灌胃等體積生理鹽水。1次/d,給藥14 d。

代謝籠收集糞便,統(tǒng)計(jì)排便粒數(shù),稱重糞便。

根據(jù)文獻(xiàn)[10]測(cè)定小鼠胃液 pH 值、胃液游離酸度、總酸、總酸排出量。

ELISA法檢測(cè)小鼠胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、胃泌素及胃動(dòng)素水平。

1.6.2 沙棘糖漿對(duì)幼齡小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響

取100只KM小鼠,♀♂各半,隨機(jī)分為5組,分別為空白組、四磨湯組(3.83mL/kg)、沙棘糖漿低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]劑量組。空白組灌胃給予動(dòng)物飲用水10mL/kg。每天一次,連續(xù)給藥14 d。第13 d給藥后,禁食不禁水8h,于第14天灌胃給藥 40 min后,各組灌胃0.8 mL營(yíng)養(yǎng)性半固體糊。20 min后頸椎脫臼處死小鼠,結(jié)扎賁門、幽門,取胃和小腸, 稱取全胃、凈胃質(zhì)量[10]。按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

胃殘留(g)=全胃質(zhì)量(g)-凈胃質(zhì)(g)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 沙棘糖漿對(duì)幼齡豚鼠止咳效果的影響

見表1。與空白組相比,沙棘糖漿高劑量組能顯著延長(zhǎng)豚鼠的咳嗽潛伏期(P<0.01);中、高劑量組均能減少豚鼠5 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)(P<0.01、0.05)。

表1 沙棘糖漿對(duì)豚鼠止咳的作用

2.2 沙棘糖漿對(duì)幼齡大鼠痰液排放量的影響

見表2。與空白組相比較,沙棘糖漿高劑量組能顯著增加大鼠痰液排放量(P<0.01),與止咳糖漿組相比,沙棘糖漿高劑量組顯著增加大鼠痰液排放量(P<0.05)。

表2 沙棘糖漿對(duì)幼齡大鼠痰液排放量的影響

2.3 沙棘糖漿對(duì)幼齡小鼠化痰效果的影響

見表3。與空白組相比較,沙棘糖漿中、高劑量組均能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05、0.01),與止咳糖漿組相比,沙棘糖漿高劑量組顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05)。

表3 沙棘糖漿對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響

2.4 沙棘糖漿對(duì)小鼠排便粒數(shù)和排便重量的影響

本試驗(yàn)造模1周后小鼠行動(dòng)緩慢,食欲下降,模型組平均攝食量比空白組下降29.3%,低于正常組20%以上,判定模型建立成功。沙棘糖漿對(duì)小鼠排便粒數(shù)和糞便重量的影響見表4。與空白組相比較,模型組小鼠排便粒數(shù)及排便重量均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,沙棘糖漿低、中、高劑量組能顯著增加小鼠的排便粒數(shù)(P<0.05、0.05、0.01);中、高劑量組能顯著增加小鼠的排便粒重量(P<0.05)。

表4 沙棘糖漿對(duì)各組小鼠排便粒數(shù)及排便重量的影響

2.5 沙棘糖漿對(duì)小鼠胃液 pH 值的影響

見表5。與空白組相比較,模型組小鼠胃液pH值升高(P<0.01)。與模型組相比較,沙棘糖漿高劑量組小鼠胃液pH值顯著降低(P<0.01)。

表5 沙棘糖漿對(duì)各組小鼠胃液pH值的影響

2.6 沙棘糖漿對(duì)小鼠游離酸,總酸,總酸排出量的影響

見表6。與空白組比較,模型組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量均升高(P<0.05)。與模型組比較,沙棘糖漿各劑量組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量均降低(P<0.01)。

表6 沙棘糖漿對(duì)各組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量的影響

2.7 沙棘糖漿對(duì)小鼠胃功能[胃泌素(GAS)、胃動(dòng)素(MTL)、胰蛋白酶(trypsin)、α-淀粉酶(α-amylase)、胃蛋白酶(Pepsin)]的影響

見表7。與空白組比較,模型組小鼠GAS濃度升高,MTL濃度、trypsin濃度(P<0.01)、α-amylase濃度(P<0.01)、Pepsin濃度降低。與模型組相比,沙棘糖漿低、中、高劑量組小鼠GAS濃度均降低(P<0.01);MTL濃度均升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);高劑量組小鼠trypsin濃度(P<0.01)、α-amylase濃度(P<0.05)、Pepsin濃度(P<0.01)升高。

2.8 沙棘糖漿對(duì)幼齡小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響

見表8。與空白組比較,沙棘糖漿高劑量組降低小鼠胃殘留、增強(qiáng)小腸推進(jìn)率(P<0.01)。

表8 沙棘糖漿對(duì)小鼠胃排空及小腸推進(jìn)作用

3 討論

沙棘糖漿是糖漿劑型道地蒙藥沙棘藥品,主治咳嗽痰多、食積腹痛[11]。研究表明,沙棘總黃酮通過阻斷ERK、PI3K/Akt和PKC信號(hào)通路,抑制IL-1β等因子誘導(dǎo)性高表達(dá),從而發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用[12]。沙棘中還含有多種營(yíng)養(yǎng)成份,促進(jìn)胃酸合成,刺激胃液分泌,具有消食健胃的作用[13]。

在止咳化痰實(shí)驗(yàn)中,通過幼齡小鼠氨水引咳,幼齡豚鼠枸櫞酸引咳,幼齡小鼠氣管酚紅排泌量,幼齡大鼠毛細(xì)管排痰量評(píng)價(jià)沙棘糖漿止咳、祛痰作用。研究結(jié)果表明,沙棘糖漿可以顯著改善檸檬酸引起豚鼠的咳嗽,增加大鼠痰液分泌量,有效促進(jìn)小鼠體內(nèi)酚紅排泌量,說明沙棘糖漿對(duì)幼齡動(dòng)物具有一定的止咳化痰作用。

在消食化滯實(shí)驗(yàn)中,通過建立食積癥動(dòng)物模型,觀察幼齡小鼠胃殘留及小腸推進(jìn)率,評(píng)價(jià)沙棘糖漿的對(duì)于消食化滯的作用。研究表明,與正常組相比較,給予沙棘糖漿處理后的小鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯提高,說明沙棘糖漿可明顯改善小鼠胃腸動(dòng)力功能。胃腸激素GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin與食積消化不良的發(fā)生密切相關(guān)。GAS促進(jìn)胃酸分泌,加強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)[14];MTL促進(jìn)胃蛋白酶分泌,可加速腸胃蠕動(dòng)及胃排空[15];Trypsin 抑制劑的分泌增加,會(huì)導(dǎo)致消化不良,生長(zhǎng)停滯[16];α-amylase與胃腸道的消化代謝息息相關(guān)[17];Pepsi的活性會(huì)隨胃酸分泌增多而增強(qiáng),從而誘發(fā)自身消化,造成胃黏膜損傷,促進(jìn)潰瘍形成[18]。本研究結(jié)果表明,模型組小鼠GAS表達(dá)下調(diào),Trypsin、、α-amylase、Pepsin表達(dá)上調(diào),說明模型組小鼠出現(xiàn)明顯胃腸動(dòng)力障礙。經(jīng)沙棘糖漿處理后,消化不良的幼齡小鼠胃液恢復(fù)正常酸度,GAS表達(dá)上調(diào),Trypsin、α-amylase、Pepsin表達(dá)下調(diào),同時(shí)有改善幼齡小鼠便秘,但沙棘糖漿對(duì)MTL水平無(wú)明顯影響,說明沙棘糖漿可能通過促進(jìn)GAS分泌,抑制Trypsin、α-amylase、Pepsin表達(dá)來(lái)改善小鼠胃腸功能,從而達(dá)到消食化滯的作用。

綜上所述,沙棘糖漿具有較好的安全性,本研究為沙棘糖漿的臨床兒童用藥及推廣提供了一定的參考依據(jù)。但仍存在一些不足:中藥方劑成分復(fù)雜,應(yīng)進(jìn)一步篩選有效成分進(jìn)行研究;本研究參照咳嗽的生理病理特點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)物模型的建立,但未能進(jìn)行多種模型之間的結(jié)果比較,模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍需統(tǒng)一;本次研究初步探討了沙棘糖漿干預(yù)前后GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin表達(dá)的變化,在機(jī)制方面的研究還有待進(jìn)一步深入探討。