膠質母細胞瘤氧化應激相關基因的表達分析

黃冠又 張 欣 甘鴻川 郝淑煜 吳 震

膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常見的原發性惡性腦腫瘤，手術聯合放化療是目前新診斷的GBM的標準治療方案，但只能小幅度提高病人的生存率[1]。由于存在血腦屏障以及獨特的腫瘤免疫微環境等生物學因素，針對GBM研制新療法仍面臨許多挑戰[2]。研究表明，膠質瘤細胞線粒體DNA突變存在較高的氧化應激，與膠質瘤細胞耐藥相關[3]。本文采用生物信息學方法構建GBM氧化應激風險模型，以預測GBM 的預后；并進行免疫細胞浸潤和腫瘤微環境分析，以期為GBM的免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源從UCSC Xena數據庫下載167例GBM病人基因表達譜數據（TCGA-GBM）。從GeneCards數據庫下載氧化應激基因集，共獲得168 個氧化應激相關基因。

1.2 氧化應激相關分子亞型分析從GBM 轉錄組中提取168 個氧化應激相關基因的表達基質，使用R包ConsensusClusterPlus 對GBM 氧化應激相關分子亞型進行一致性聚類分析，比較不同亞型病人之間的生存差異。

1.3 免疫微環境分析應用ESTIMATE算法分析免疫細胞和基質細胞的特異性基因表達特征，計算免疫評分和基質評分，并評估兩組間的immune/stromal/ESTIMATE評分和腫瘤純度差異。

1.4 差 異 表 達 基 因（differential expression genes，DEGs）的鑒定 使用R 包DESeq2 進行差異分析，使用R包ggplot2和pheatmap繪制火山圖和熱圖顯示篩選出的DEGs。

1.5 DEGs的功能富集分析 使用R 包ClusterProfiler對所有DEGs進行GO分析和KEGG通路富集分析。

1.6 PPI網絡的構建基于獲得的氧化應激DEGs，通過檢索STRING在線數據庫構建PPI網絡，使用cyto?Hubba插件計算網絡中各節點蛋白度值（Degree），以基因在網絡中的前10 位Degree 值作為關鍵基因篩選標準，分析關鍵基因與免疫檢查點分子、免疫因子的相關性。

1.7 關鍵基因與免疫相關性分析從TISIDB 數據庫下載免疫因子，分別計算其與關鍵基因的相關系數，并繪制熱圖。從TCGA-GBM 隊列中提取45 個免疫檢查點，分析其與關鍵基因的表達相關性。

2 結果

2.1 氧化應激相關分子亞型的鑒定結果共鑒定出兩種與氧化應激相關的GBM分子亞型（圖1A），其中Cluster1含93個樣本，Cluster2含74個樣本。兩個亞型GBM 生存期有統計學差異，Cluster1 生存期明顯高于Cluster2（P=0.041，圖1B）。與Cluster1 相比，Cluster2 免疫評分（圖1C）、基質評分（圖1D）和估計評分（圖1E）明顯增高（P<0.05），而腫瘤純度明顯降低（圖1F；P<0.05）。

圖1 GBM氧化應激相關亞型鑒定和腫瘤微環境評分

2.2 GO和KEGG富集分析GO分析結果表明，DEGs在細胞因子/趨化因子相關功能中顯著富集，主要包括細胞因子介導的信號通路、細胞對趨化因子的反應和受體-配體活性等。KEGG分析結果表明，DEGs顯著富集在細胞因子/趨化因子相關通路，如細胞因子受體互作反應、病毒蛋白與細胞因子受體互作反應等。

2.3 PPI網絡鑒定關鍵基因按照Degree值從高到低依次為：CSF2、CSF3、CCL7、LCN2、CXCL6、MMP8、CCR8、TNFSF11、IL22RA2、ORM1。應用Cytoscape軟件重建關鍵基因的相互作用。

2.4 關鍵基因的免疫相關性分析大多數免疫因子和免疫檢查點與關鍵基因呈正相關（圖5A～E），其中免疫抑制因子IL10、免疫刺激因子IL2RA、趨化因子CCL2和免疫檢查點LAIR1與關鍵基因CCL7呈正相關，免疫受體CCR4與關鍵基因CCR8呈正相關。免疫抑制因子VTCN1、免疫檢查點LAG3、免疫刺激因子TNFRSF13C 和LTA、趨化因子CXCL17、CCL25 與大部分關鍵基因呈負相關。

3 討論

研究表明，氧化應激與膠質瘤的關系密切且復雜，高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）影響膠質瘤細胞的功能[4]。ROS 作為正常細胞代謝的產物，可以調節細胞的存活、增殖、凋亡及細胞內環境穩定。當內環境穩態受損，氧化應激狀態與膠質瘤的發生和耐藥性有關[5]。研究表明，氧化應激影響腫瘤內和細胞間分子異質性，產生免疫調節逃逸和或對傳統療法的抵抗[6，7]。本文通過聚類分析鑒定出GBM 兩種預后的分子亞型，即Cluster1 和Cluster2，Cluster2 組病人預后要差于Cluster1 組（P<0.05），而且免疫評分、基質評分、ESTIMATE 評分較高，而腫瘤純度較低。這提示氧化應激相關分子亞型有助于對GBM進行預后的分層分析。

本文通過篩選氧化應激相關分子亞型之間的DEGs，并對候選關鍵基因進行富集分析發現，細胞因子介導的信號通路、細胞對趨化因子的反應、信號受體激活劑活性、細胞因子活性和趨化因子受體結合等在GBM發病過程中具有重要作用。這些DEGs主要在信號受體激活劑活性、分泌顆粒內腔和細胞因子介導的信號通路相關的功能或通路中發揮作用。本文KEGG分析顯示DEGs在細胞因子-細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路和JAK-STAT 信號通路的富集最顯著。研究顯示細胞因子和趨化因子在多種人類惡性腫瘤中表達上調，既有抗腫瘤作用，也有促進腫瘤作用[8]。這些可溶性介質（如CCL2、CCL5、CXCL12、IL-6、TGF-β、CSF-1 等）在GBM 的腫瘤微環境中具有重要的免疫調節作用[9～13]。這提示可溶性趨化因子和細胞因子在腫瘤微環境的免疫調節作用促進GBM的發展。

本文PPI 網絡分析篩選出前10 個對GBM 影響最大的關鍵基因（CSF2、CSF3、CCL7、LCN2、CXCL6、MMP8、CCR8、TNFSF11、IL22RA2、ORM1）。Sielska等[14]通過TCGA 數據集和GBM 細胞學研究發現CSF2 表達上調，并證實CSF2 可誘導小膠質細胞募集和巨噬細胞極化，聯合免疫檢查點抑制劑和靶向CSF2信號可能是治療GBM的一個靶點。Gao等[15]通過常氧和缺氧條件下對GBM 細胞系進行轉錄組分析，發現CSF3可作為GBM潛在的血漿標志物之一，這為GBM 的診斷和治療提供新的思路和方向。趨化因子CCL7 通過與受體結合來介導免疫細胞的募集，是調節腫瘤免疫微環境的形成并參與腫瘤形成。研究發現，在Tim-3 高表達的GBM 樣本中，CCL7、CXCL13、CCL18 等表達顯著上調，這些上調的趨化因子可能促進GBM進展，并與GBM的不良預后相關[16]。LCN2作為一種免疫調節劑，參與各種生物反應和病理生理過程，包括氧化應激。LCN2 在GBM 中作用機制尚不清楚。Hsieh 等[17]研究發現GBM中LCN2表達水平低于正常組織，并且LCN2表達水平較低與GBM較差的生存預后相關。

本文結果表明，多數免疫因子和免疫檢查點與氧化應激關鍵基因呈正相關，其中免疫調節因子IL10 和IL2RA、趨化因子CCL2、免疫檢查點LAIR1與關鍵基因CCL7 正相關程度最高，免疫受體CCR4與關鍵基因CCR8 正相關程度最高。IL-10 除了具有免疫抑制和免疫刺激激活的免疫調節功能外，還通過增加腫瘤細胞增殖來促進腫瘤進展。在GBM腫瘤微環境中，IL-10 主要來源于腫瘤相關巨噬細胞，發揮免疫抑制作用，促進腫瘤進展和免疫逃逸。研究發現IL-10 在GBM 中的作用對于改善GBM 的免疫療法具有重要作用[18]。細胞因子信號通路上的IL2RA 基因遺傳變異可能會增加GBM 的發病風險，并且在GBM 腫瘤微環境中具有免疫抑制作用[19]。CCR2/CCL2 信號通路可以促進血管生成、炎性反應以及免疫抑制作用，從而促進腫瘤生長[20]。

總之，本文基于氧化應激相關基因將GBM劃分為兩個亞型，不同亞型生存情況存在明顯差異；并且篩選出10個氧化應激關鍵基因，這些關鍵基因可能對GBM的發生和預后起重要作用，可以為GBM的個體化治療提供參考和新的方向。