微生物法測定蔬菜中葉酸含量

蔣 偉，李白玉

（湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南長沙 410007）

葉酸是人體所必需的一種B族維生素，其在代謝循環過程中的作用非常重要。人體缺乏葉酸會導致各種各樣的問題，包括巨幼細胞貧血、神經管畸形等疾病[1]。葉酸無法由人體自身合成，只能從外界攝取，一般從食物中得到[2]。因此，人體對于葉酸的攝入狀況是非常值得注意的問題。蔬菜是人類獲取葉酸的重要來源之一[3]，了解當地常見蔬菜的葉酸含量對于指導人們日常補充葉酸具有重要意義。本文以某地區較常食用的蔬菜作為研究材料，通過微生物法使用鼠李糖乳桿菌測定分析蔬菜中葉酸的含量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC7469）；菌種儲備瓊脂培養基：Becton，Dickinson and Company；葉酸測定用培養基：海博生物公司。葉酸標準品：純度99.7%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

磷酸鹽緩沖液終濃度為0.05 mol·L-1，pH 6.8；氫氧化鈉乙醇溶液終濃度為0.01 mol·L-1；蛋白酶-淀粉酶液配比為200 mg木瓜蛋白酶、200 mg α-淀粉酶、20 mL磷酸鹽緩沖液，蛋白酶-淀粉酶液需要現用現配；氫氧化鈉-乙醇溶液中氫氧化鈉終濃度為1 mol·L-1，乙醇溶液中乙醇與水的體積配比為2∶8。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌菌種的活化

使用菌種儲備用瓊脂培養基活化鼠李糖乳桿菌，具體方法是36 ℃培養1 d，并用相同的方法傳種2次。最新的菌株即儲備菌株，保存于4 ℃環境。實驗前兩天，將儲備菌株活化，使用同種培養基于36 ℃繼續培養1 d。

正式實驗的前一天，將活化的菌株轉種至液態培養液中進一步活化增殖，36 ℃培養1 d。取0.5 mL活化增殖后的菌種轉種至5 mL無菌的葉酸測定培養基，不添加葉酸，36 ℃培養6 h即得接種液。此步驟注意無菌操作，培養時間可適當延長，確保接種液中殘存的多余葉酸被消耗掉。

1.2.2 葉酸測定的標準曲線繪制

將葉酸標準品先用氫氧化鈉-乙醇溶液逐級稀釋為濃度0.200 μg·mL-1的中間液，再用水將中間液稀釋為終濃度0.200 ng·mL-1的標準工作液，注意此工作液需要現用現配。葉酸測定的標準曲線配制體系見表1，每個濃度梯度做3個平行，即標準曲線測定管。后續混菌及加入培養基培養步驟與樣品測定管采用相同操作。待檢測工作完成后，以標準管的葉酸含量作橫坐標，各標準點的吸光值均值作縱坐標，生成標準曲線。

表1 標準曲線系列管的配制

1.2.3 蔬菜樣品制備與測定

本實驗所用的蔬菜全部購自某地區的菜市場及超市。將買來的新鮮蔬菜分別勻漿混勻，稱取適量蔬菜試樣轉進適當大小的錐形瓶，加入30 mL磷酸緩沖液，搖勻，121 ℃高壓水解15 min。待錐形瓶冷卻至室溫，繼續加入蛋白酶-淀粉酶液和雞胰腺液各1 mL，搖勻后加入甲苯4滴，36 ℃恒溫酶解20 h。將所有內容物轉移至100 mL的容量瓶中，加水定容，過濾。另準備單獨的錐形瓶同上操作，不加樣品，即酶空白液。最終的待測液需要根據試樣中葉酸的含量進一步進行適當稀釋，待測液最佳葉酸含量需要控制在0.2～0.3 ng·mL-1。

每個樣品的待測液需要做3個不同濃度梯度的測定系列管，具體測定系列管的配制見表2，每個濃度梯度做3個平行，另取3支試管加入酶空白液。將葉酸測定培養基和全部測定管分別121 ℃高壓滅菌15 min，待兩者都降溫到室溫后，將接種液按4 mL·L-1的比例混入葉酸測定培養基，混勻，接著將培養基按5 mL/管的量分裝到各測定管，再次混勻。放入36 ℃培養箱培養一天，直到混濁度最大時拿出測定吸光值。另備一支既不接種也不含葉酸的標準管作0對照管。培養結束后，各系列管需要在測定前再次漩渦，將紫外可見分光光度計調至540 nm處測定吸光值，留意用0對照管調零。按葉酸標準曲線求出各樣品待測液濃度，再按照處理步驟中不同的稀釋倍數，換算求出每100 g新鮮蔬菜中葉酸的含量。

表2 樣品測定系列管的配制

2 結果與分析

2.1 蔬菜葉酸含量測定結果

在某地區不同的菜市場和超市中購得常見的25種蔬菜，具體檢測得到的葉酸含量平均值見表3。由表3可知，菠菜葉酸含量最為豐富，為236.0 μg/100 g；其次為西蘭花，葉酸含量為137.0 μg/100 g。其余蔬菜的葉酸含量都低于100 μg/100 g。

表3 不同種類蔬菜的葉酸含量

2.2 不同品種蔬菜的葉酸含量比較

此次檢測的25種不同種類的蔬菜，葉酸含量平均值為10.7～236.0 μg/100 g，不同種類的蔬菜葉酸含量差異較大。深色蔬菜以菠菜葉酸含量最為豐富，淺色蔬菜以大白菜的葉酸含量較為豐富。整體而言，深色蔬菜較淺色蔬菜的葉酸含量略高。相比豆類、瓜類和根莖類蔬菜，葉類蔬菜整體葉酸含量相對較高。

2.3 不同售賣途徑的同品種蔬菜葉酸含量比較

此次檢測的25種蔬菜，從整體上看，不同售賣途徑的同種蔬菜的葉酸含量也有明顯差異。例如，5處不同來源的菠菜，葉酸含量平均值為236.0 μg/100 g，實際含量為82.2～332.0 μg/100 g；5處不同來源的西蘭花，葉酸含量平均值為137.0 μg/100 g，實際含量為41.5～203.0 μg/100 g。推測蔬菜的葉酸含量不僅受到具體品種的影響，也會受到產地的種植環境、采摘后的運輸儲存條件等因素的影響。

2.4 置放時間對葉酸含量的影響

為探討蔬菜置放后葉酸是否有流失，選取菠菜和大白菜在置放一周后重新測定葉酸含量，發現菠菜葉酸平均含量由236.0 μg/100 g下降至54.3 μg/100 g，殘留率僅為23.0%；大白菜葉酸平均含量由93.4 μg/100 g下降至40.1 μg/100 g，殘留率僅為42.9%。由此可見，新鮮蔬菜的葉酸含量并不穩定，在置放過程中蔬菜里的葉酸會被逐漸消耗或分解。由此可以推測，蔬菜本身的新鮮程度會對葉酸的留存量產生較大影響，由較近產地直接運來的較為新鮮的蔬菜，葉酸檢測值會相對較高。而經過多重清理和運銷作業等操作的蔬菜，尤其是經過長時間轉運的蔬菜，增加了葉酸被破壞的可能性，可能會導致相應蔬菜的葉酸檢測值偏低。

2.5 關于檢測方法的一些思考

微生物法檢測葉酸含量，本質上檢測的是具有生物活性的多種葉酸母體及其衍生形式的總量。相比起儀器分析法針對單一組分的檢測，微生物法的數據能更好地反映蔬菜中天然葉酸的總量。微生物法檢測過程中，相關器皿的清潔程度非常重要，異物殘留會引起菌液的異常增殖，進而導致定量失敗。建議實驗中使用到的相關玻璃器皿，實驗前先用硫酸重鉻酸甲溶液浸泡24 h以上，蒸餾水清洗后再用烘箱250 ℃干熱2 h。

3 結論

測定了25種人們經常食用且容易購買到的蔬菜的葉酸含量，結果顯示菠菜的葉酸含量最為豐富。葉酸含量雖因蔬菜而異，但大多數蔬菜中葉酸的含量在10～100 μg/100g。由于蔬菜是人們攝取葉酸的主要食物來源之一，因此本實驗數據可為初步估算人們葉酸攝取量提供參考。富含葉酸的葉類蔬菜在置放一周后存在葉酸流失的情況，因此估算葉酸可獲率時，應考慮蔬菜的食用時間以及保存狀況等信息。值得注意的是，近年來許多研究亦顯示葉酸在心血管等慢性疾病治療中扮演非常重要的角色[5]。因此，含葉酸食品的攝入量與人們患慢性疾病的相關性，以及增進葉酸攝取對維護人體健康的效益，仍是待研究與了解的問題。