維生素B12檢測方法發展現狀研究

王 玨

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051）

維生素B12是B族維生素中的一類，其和人們的健康息息相關，通常以輔酶的形式參與人體各種代謝活動，有促進甲基形成、維持巰基還原狀態和促進細胞成熟等多種功能。如果人體缺乏維生素B12將會引起神經紊亂、心臟病甚至是癌癥等嚴重疾病，因此維生素B12受到了人們越來越多的關注。但維生素B12在人體內的含量很少，體外穩定性較差，化合物組成復雜，對其進行分析存在相當的難度。因此，選擇精準且高效的維生素B12檢測方法也就顯得極為重要。

1 維生素B12性狀及功能

維生素B12（Vitamin B12），又名鈷胺素，是一種含鈷的咕啉類化合物的總稱，同時其也是人體內唯一一種含有金屬元素的水溶性維生素，由Elders等人于1926年在使用肝浸膏治療惡性貧血癥時首次發現。維生素B12為紅色結晶體，其熔點較高（＞320 ℃），沒有特殊氣味，且易溶于水、乙醇、甲醇等溶液，但不溶于乙醚、丙酮等溶液。維生素B12溶于水后的水溶液呈現中性，且性狀表現穩定，但在處于強酸（pH＜2）或者強堿（pH＞9）的環境中易分解。

維生素B12是一種結構較為復雜的小分子，其化學分子式為CoC63H88O14N14P，相對分子質量為1 355.38，呈類八面體結構。一般來講，動植物自身不具有合成維生素B12的能力，因此人類攝入的絕大部分維生素B12來源于肉類和海產品，而小部分的發酵食品也會含有少量的維生素B12。在自然界中，能夠生成維生素B12的主要是放線菌、細菌、米根霉菌等微生物。對于動物來講，由于其腸道內所共生的細菌種類較多，其中諸如干酪乳桿菌等具有合成維生素B12的能力，因此在這些細菌的作用下，動物也能夠產生不同水平的維生素B12，以維持身體正常的代謝活動。

2 維生素B12檢測方法

2.1 液相色譜-質譜法

液相色譜質譜法作為一種新興的分析檢測方法，它的出現為食品分析檢測技術提供了更為多元化的選擇。液相色譜-質譜分析法將液相色譜所擁有的高效迅速以及質譜所擁有的高靈敏度、強定性力等優點有效結合起來，可以對多種不同的樣品開展定性以及定量化分析。施煜等[1]采用液相色譜-質譜法對運動飲料中維生素B12等維生素進行了測量，樣品用水進行超聲提取之后，采用ACQUITY HSS T3液相色譜柱分離，以濃度為0.1%的甲酸甲醇混合溶液作為流動相進行梯度洗脫，相關系數＞0.999，回收率為90%～102.3%，實驗結果表明該方法適用于對運動飲料中所含維生素含量進行測定。顧文等[2]采用UPLC-MS法對固體飲料中的維生素B12含量進行測定，以醋酸為提取液，采用Strata C18固相萃取柱凈化并富集維生素B12，經過洗脫定容之后再采用Agilent ZORBAXSB-Aq C18高效色譜柱分離，進行定量檢測，研究結果表明采用該方法對維生素B12進行檢測具有較高的精準度和重現性。

2.2 微生物法

微生物法也是一種常見的維生素測定方法，主要利用維生素的特異性，在特定環境下對微生物進行培養，并利用微生物的新陳代謝來對維生素進行測定。宴濤等[3]采用微生物法對功能性飲料中的維生素B12含量進行了研究，利用萊士曼氏乳酸桿菌生長速率與B12濃度的線性關系，制備標準曲線，根據標準曲線計算樣品中B12的含量，相關系數為0.993，在0～0.1 ng，吸光度值與維生素B12含量呈現出良好的線性關系。韓冀等[4]采用微生物法對寵物食品中的維生素B12進行了測定，將均質樣品加入50 mL無菌離心管中，然后加入40 mL去離子水，在95 ℃水浴中提取30 min，快速冷卻之后，用0.22 μm無菌濾膜過濾取濾液，經過處理后采用微生物法進行檢測，回收率為94.0%～106.0%；試驗結果表明，采用微生物法對寵物食品中維生素B12含量進行測定具有靈敏度高、精準度較高的優點。

2.3 分光光度法

采用分光光度法檢測維生素B12主要是利用維生素B12具有水溶性的特點，對紫外線有較強的吸收作用。采用分光光度法測定維生素B12具有靈敏度較高、操作簡便以及使用成本較低的優點。湯家華等[5]采用分光光度法對維生素B12中鈷的含量進行了測定，將一定量的樣品溶液轉移至10 mL容量瓶中，再依次向其中加入pH值為9.2的緩沖溶液2.0 mL、50 g·L-1TritonX-100 2.0 mL、0.4 g·L-15’-硝基水楊基熒光酮溶液1.0 mL，用超純水定容至刻度后，搖勻，然后在波長為546 nm處檢測試樣的吸光度。研究結果表明，表觀摩爾吸光系數為3.7×104L·mol-1·cm-1，RSD為2.2%，回收率為96%，滿足分析要求。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法作為當今一種重要的技術平臺，其具有高靈敏度、高分辨率以及高通量等優點，使其成為檢測維生素B12時常用的一種方法。高效液相色譜法通常會采用C18色譜柱，用流動相進行洗脫完成對維生素B12的分離，因此該方法適用于對血液或者藥品中維生素B12進行檢測。為有效降低高效液相色譜法檢測維生素B12的檢出限，研究人員開發出了多種新型的前處理方法，提升了檢測的精準度。

隨著科學技術的不斷發展，液相色譜法被不斷優化和改進，并被廣泛應用在了各種化合物的檢測中。何文等[6]采用高效液相色譜法對嬰幼兒乳粉中維生素B12含量進行了測定，乳粉樣品經過水溶解后，經免疫親和柱凈化，進行超聲提取、高速離心之后過濾，然后上機進行檢測，采用流動相為甲醇溶液，色譜柱溫度為40 ℃，檢測波長為361 nm，采用外標法對維生素B12開展了定量分析。賀習文等[7]則采用磷酸鹽和甲醇的混合液作為流動相，檢測波長設定為361 nm，對飼料中含有的維生素B12進行了檢測。檢測結果顯示，該方法具有良好的線性，相關系數為0.999 9，檢出限為0.05 μg·mL-1，具有較高的檢測準確度。

2.5 原子吸收光譜法

原子吸收光譜法也是一種十分重要的維生素B12檢測方法，其主要是利用維生素B12中所含有的配位金屬原色鈷，對鈷含量進行測定，進行相應的換算即可得出維生素B12的含量。用該方法來檢測維生素B12具有檢出限較低、靈敏度較高、重復性較強等諸多優點，因此被廣泛應用于各種保健品以及嬰幼兒乳品中維生素B12含量的檢測。畢雪艷[8]采用火焰原子吸收法對維生素B12中鈷的含量進行了測定，檢測波長設定為240.7 nm，乙炔流量為2.0 L·min-1。檢測結果表明，鈷濃度在一定范圍內具有良好的線性關系，回收率為98.8%，該方法測定維生素B12鈷含量具有靈敏度高、結果精準等優點。

2.6 毛細管電泳法

毛細管電泳法的應用始于1980年代末期，是一種以高壓電場作為驅動力，以毛細管作為分離通道，結合樣品中各個組分之間淌度和分配行為上的不同來實現分離的一種液相方法。毛細管電泳法具有快速高效的優點，因此被廣泛應用于水溶性維生素的檢測。

2.7 化學發光法

從分類上來看，化學發光法屬于分子發光光譜分析法的一種，其主要是利用化學檢測體系中被測樣品濃度與體系的化學發光強度在一定范圍內呈線性關系的原理，使用專業的儀器來對體系化學發光強度進行檢測，進而對被測樣品進行分析。因此，采用化學發光法檢測食品中維生素B12是以某些特定試劑能夠與維生素B12產生反應發光為基礎的。朱金坤等[9]建立了一種新型毛細管電泳-化學發光法檢測維生素B12，線性范圍為6×10-7～6×10-4mol·L-1，RSD為2.4%，回收率為97%～106%。實驗結果表明，采用該方法對維生素B12進行檢測可以得出更為精準、可靠的檢測數據。

2.8 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定法是一種在免疫酶技術基礎上研發出的新型免疫測定技術，由瑞典學者Engvall等人于1971年首次提出，其主要原理是通過抗體和酶復合物結合，通過顯色反應來對樣本進行檢測。李江等[10]采用酶聯免疫吸附法對嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量進行了檢測，采用60%的甲醇溶液來提取奶粉樣本，采用酶聯免疫吸附檢測試劑盒標板來包被有維生素B12的抗原，并讓其保持免疫活性，然后加入酶反應底物，根據顏色變化的深淺來對維生素B12進行定量分析。實驗結果表明，采用該方法測定維生素B12的相關系數為99.7%，檢出限在3～243 μg·kg-1，具有較高的靈敏性和精準度，且操作方法較為簡單。

3 試劑盒法與國標法測定維生素B12的比較

鑒于維生素B12具有不穩定性，在對樣本進行采集、轉移和存儲過程中要特別注意環境溫度和光照環境，并依據具體的保存條件在規定時間內對樣本進行檢測，以確保檢測結果的準確性。當前針對維生素B12含量進行檢測的方法多種多樣，而在實際應用過程中較為常見的兩種方法為國標法和試劑盒法。余文[11]采用試劑盒法對嬰幼兒乳粉以及功能飲料中維生素B12的含量進行了快速檢測，實驗結果表明經過優化的試劑盒法能夠有效縮短實驗所需時間，且操作較為簡單，將其和國標法進行比較，其具有精準可靠、操作方便的特點。陳敏兒等[12]則比對了國標法和試劑盒法測定維生素膠囊葉酸含量，實驗結果表明，國標法和試劑盒法都具有較高的重復性，且兩種方法的相對偏差均小于4%。在精密度方面，國標法的回收率保持在100%～105%，相對標準偏差在2%～4%；試劑盒法的回收率則保持在78.5%左右，相對標準偏差高于4%。由此可以看出采用試劑盒法檢測精準度較低，但相較于國標法，采用試劑盒法進行檢測也有著操作步驟較為簡單、污染概率較低以及方便快捷的優點。因此，在實際工作過程中，應結合具體的檢測要求來選擇最為科學的方法。

4 結語

當今人們對于健康的關注程度越來越高，而維生素B12作為一種維持人體正常新陳代謝的重要有機化合物，必將會引起全社會的廣泛關注。雖然現如今針對維生素B12的檢測方法多種多樣，但每種方法都具有各自的優缺點和適用領域，因此在實際使用過程中，也應結合具體的檢測需求選擇最為合適的檢測方法。隨著科學技術的不斷進步，維生素B12的檢測方法將會朝著更加精準、穩定、快速、高效的方向發展。