circRNA與膀胱癌關系的研究進展

高夢 榮勝忠 任志穎 苗國慶 李曉霞

[摘要]?環狀RNA（circular?RNA，circRNA）是一類具有環形結構的非編碼RNA分子，主要存在于真核生物中，內部結構穩定，可經由多種途徑發揮作用。膀胱癌（bladder?cancer，BC）是目前最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，且近年發病率較高。由于缺乏特異性腫瘤標志物，早期BC往往不能被及時發現，因此對特異性腫瘤標志物進行探索，具有很大的臨床意義和價值。circRNA作為研究方向，值得進一步深入，本綜述較為系統的介紹了circRNA及其與膀胱癌的關系，并對現有研究的局限性進行了展望。

[關鍵詞]?circRNA；生物發生；分子特征；生物學功能；膀胱癌；生物標志物

[中圖分類號]?R737??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.026

膀胱癌（bladder?cancer，BC）是最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，其發病率在世界排名第9位[1]，目前還沒有針對侵入性高級別BC的完美治療方法。臨床主要以手術切除與化療為主，但BC中晚期時易發生遠處轉移，耐藥嚴重，且臨床效果較差，療效通常并不理想。由于缺乏特異性的診斷和治療方法，大多數患者無法在早期被及時發現。因此，探索新的生物標志物和確定膀胱癌的有效治療靶點至關重要。人類基因組中，非編碼RNA占據了真核基因組上總RNA的95%。非編碼RNA中主要分為轉錄的超保守區、微RNA（microRNA，miRNA）、小核仁RNA、與PIWI相互作用RNA、長鏈非編碼RNA和環狀RNA（circular?RNA，circRNA），circRNA是具有環形結構的非編碼RNA分子[2-3]。隨著高通量測序技術和基因生信分析的迅速發展，近些年已經成功鑒定了成千上萬個circRNAs，證實circRNA具備組織特異性的表達模式。

1??circRNA的生物發生

circRNA源自前體mRNA，具有顯著的連續閉環結構，通過自由3′和5′端共價連接，又稱為“反向剪接”結構[3]。反向剪接結構的形成不僅需要規范的剪接信號，還需要規范的剪接體機制。多種途徑參與circRNA的環化。circRNA一般可分為3種：外顯子環狀RNA（exonic?circRNA，ecircRNA），環狀內含子RNA（circular?intronic?RNA，ciRNA）和外顯子–內含子環狀RNA（exon-intron?circular?RNA，EIciRNA）[4]。RNA結合蛋白配對和內含子配對直接驅動環化circRNA形成的反向剪接途徑。肌盲蛋白（muscleblind?protein，MBL）、Quaking（QKI）和RNA特異性腺苷脫氨酶1（adenosine?deaminase?acting?on?RNA?1，ADAR1）等RNA結合蛋白參與調控circRNA的發生。MBL和QKI與側翼內含子的序列基序結合并將兩個側翼內含子連接在一起，調節相鄰的剪接位點以促進circRNA的形成[4]。ADAR1通過與雙鏈RNA結合并融合莖結構來抑制circRNA的形成，從而產生ecircRNA和EIciRNA。關于內含子配對，側翼內含子中反向重復Alu元件的替代形成及跨側翼內含子或單個內含子內部的RNA配對之間的競爭都可能引起替代環化，進而引起單個基因產生了多個circRNAs和線性轉錄本[5]。此外，circRNA可以通過含有外顯子的套索驅動途徑產生，由外顯子跳躍事件形成帶有外顯子的套索，再通過套索內部剪接去除側翼內含子序列，最終產生ecircRNA或EIciRNA[6]。ciRNA也是通過套索衍生的機制而形成的，該機制基于一個共識基序，該基序在5'剪接位點附近包含一個7-nt的富Gu元件，在分支點位點附近包含一個11-nt的富C的元件[7]。據報道，古細菌和真核生物中都存在另一種保守的circRNA生物發生模式。在這種情況下，轉運核糖核酸（transfer?ribonucleic?acid，tRNA）剪接核酸內切酶復合物會在凸起–螺旋–凸起基序處切割含內含子的前tRNA，然后將外顯子兩半連接起來，內含子末端也連接起來形成tRNA內含子環狀RNA[8]。當剪接體或轉錄終止因子在細胞中耗盡時，circRNA成為首選的基因輸出，通過抑制或減緩規范的前mRNA加工事件，將蛋白質編碼基因的穩態輸出傳遞至環狀RNA[9]，為更好地理解circRNA的產生提供了參考。

2??circRNA的特征

circRNA擁有一些共同的特征，主要如下：①廣泛的分布和多樣性，在植物、動物及所有組織的許多真核生物中，均存在circRNA[10]；②高度的穩定性，由于具有封閉的環形結構特點，circRNA對核糖核酸酶R的降解產生了抗性，且比線性RNA穩定；③特定的表達方式，在不同的發育階段和不同的細胞與組織中，circRNA有相應的表達；④序列保守性，研究證明，許多circRNA在物種間的進化方面存在序列保守性[10]；⑤正常與病理狀態的動態表達譜，研究發現許多circRNA在正常組織和癌癥組織之間的表達發生了變化[11]；⑥主要由外顯子衍生而來，由單一或多個外顯子組成，而且一個最小的外顯子長度能形成反向剪切。

3??circRNA的生物學功能

3.1??充當miRNA海綿

miRNA是非編碼RNA家族中的一類短的小分子RNA，能夠調控轉錄過后的基因表達水平，特別是在癌癥中。circRNA可以作為內源競爭性RNA，通過與miRNA結合并阻止miRNA調節其下游靶基因來影響基因表達。例如，人類小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（cerebellar?degeneration?related?protein?1?antisense，CDR1as/ciRS-7）和小鼠Y染色體性別決定區（sex?determining?region?Y，Sry）是兩個最著名的circRNA充當miRNA海綿的示例。CDR1as下調許多癌癥相關信號通路中致癌因子的表達，從而通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein?kinase?B，PKB/AKT）途徑調節肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲途徑[12]。據報道circBIRC6直接與miR-34a和miR-145相互作用調節維持多能性的靶基因，circBIRC6減弱這些靶基因的下調并抑制人類胚胎干細胞的分化[13]。越來越多的circRNA被發現作為miRNA海綿，如circHIPK3能夠與9個miRNA結合，還能與miR-124結合并抑制其活性，在癌細胞中產生強增殖作用[14]。由此可見，海綿化miRNA可能是許多circRNA的重要作用機制，circRNA可以海綿化許多不同的miRNA，而并非通過結合某個特定的miRNA的多個位點產生生物抑制或致癌功能。

3.2??與蛋白質相互作用

circRNA還可以與蛋白質相互作用以調節基因表達。MBL是人類盲肌樣蛋白1（muscleblind?like?splicing?regulator?1，MBNL1）的同源物，該基因在果蠅和人類體內產生circMbl，其與MBL側翼內含子擁有傳統的肌盲結合位點，從而強力而特異地結合，促進新生RNA環化和circMb1的生物發生，MBL含量的變化強烈影響circMbl的生物合成，這種作用主要依賴于MBL的結合位點[15]。其他circRNA如circPABPN1和circANRIL，也可通過與靶蛋白相互作用來發揮重要作用。circPABPN1與RNA結合蛋白HuR大量結合，使HuR與PABPN1mRNA的結合減少，降低PABPN1的翻譯水平，通過與翻譯激活因子HuR競爭而降低其可用性，調節PABPN1mRNA的翻譯[16]。circANRIL通過與pescadillo核糖體生物發生因子結合，影響了前核糖體RNA的加工和核糖體的生物發生，因此，circANRIL可以誘導核仁應激和p53的激活，隨后凋亡增加，增殖率下降，這一途徑可以通過在動脈粥樣硬化斑塊中消除過度增生細胞來促進動脈粥樣硬化保護[17]。另外，某些circRNA如circ-Amotl1和circ-Foxo3，可充當蛋白質的支架，促進酶及其底物的共定位。circ-Amotl1能夠結合3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent?kinase?1，PDK1）和AKT1，并促進AKT1的PDK1依賴性磷酸化。AKT1隨后轉移到細胞核，在小鼠模型中顯示出心臟保護功能[18]。circ-Foxo3的主要作用之一是促進小鼠的由雙微體同源基因2介導的突變p53泛素化，使其靶向蛋白酶體誘導降解[19]。最后，circRNA可能會把某些特定蛋白募集到細胞的特定位置，如circFECR1可把甲基胞嘧啶雙加氧酶1募集到其宿主基因FLI1的啟動子區域，從而引起CpG位點的去甲基化和轉錄活性[20]。

3.3??調控轉錄

circRNA可以順式或反式影響其親本基因。ciRNA由脫離分支結構的套索內含子產生，通常積聚在人類細胞的細胞核中，并通過與RNA聚合酶Ⅱ（polymerase?Ⅱ，Pol?Ⅱ）機制相互作用，使其親本編碼基因的轉錄得到調節，從而發揮RNA?Pol?Ⅱ轉錄的順式調節作用[7]。同時，EIciRNA能夠與U1小核糖核蛋白和Pol?Ⅱ相互作用，使親本基因的轉錄得到促進[21]。

3.4??翻譯

circRNA曾被視為非編碼RNA，但最近的研究成果表明了circRNA參與翻譯的能力。真核生物核糖體翻譯僅需要內部核糖體進入位點（internal?ribosome?entry?site，IRES）元件[22]。此外，在人類基因組中已經發現了數千個新的與帽無關的翻譯序列，進一步表明circRNA可能是可翻譯的[23]。研究顯示，circRNA在活體細胞中可通過滾動循環擴增機制高效翻譯，產生豐富的蛋白產物[24]。研究人員還發現大量的circRNA能夠成為信使RNA，并利用N6-甲基腺苷來編碼非帽依賴性翻譯機制的蛋白[25]。據報道，circRNA的一個子集與翻譯核糖體有關，其通常與宿主RNA共享起始密碼子，編碼具有特定蛋白質結構域的蛋白質，并以不依賴帽的方式翻譯[26]。最近的一項研究也證明，circ-FBXW7能夠直接翻譯成一個與親代基因編碼的FBXW7蛋白相關聯的蛋白，使核蛋白類癌基因c-Myc的穩定性得到調整，進而阻止膠質瘤的發展[27]。

4??circRNA與膀胱癌的關系

研究顯示，許多circRNA在BC組織和健康的鄰近組織中存在差異表達。circRNA與BC相關的功能有促進腫瘤和抑制腫瘤兩種。與健康的鄰近組織、正常組織和正常細胞系相比，許多circRNA如circBPTF、circTFRC、circPDSS1、circZFR等在BC組織和細胞系中的表達水平均升高，并在促進腫瘤發展中發揮作用。這些circRNA的高水平與BC的臨床病理階段密切相關，并影響BC的生存。例如，在BC的臨床分期中，circPDSS1的表達水平不同，該分期越高，表達水平越高[28]。腫瘤復發是影響預后的一個重要因素，研究發現circBPTF與BC的復發密切相關，復發性腫瘤組織可顯示出比原發性腫瘤組織更高的circRNA水平[29]。

4.1??促癌因子

4.1.1??circBPTF??circBPTF在BC組織和細胞系中的表達明顯高于非癌組織和細胞系，circBPTF的過度表達與BC患者的不良生存率、較高的腫瘤分期和腫瘤復發相關，表明circBPTF在BC中發揮致癌作用[29]。

4.1.2??circTFRC??circTFRC在BC組織中表達上調，并與患者的腫瘤分級和生存率相關，基因敲除circTFRC可抑制BC細胞體外侵襲、增殖和體內腫瘤生長，circTFRC通過吸收靶向TFRC的miRNA-107上調TFRC的表達，從而促進BC組織中上皮-間質轉化、細胞增殖和細胞侵襲[30]。

4.1.3??circPDSS1??circPDSS1在膀胱尿路上皮癌（urothelial?bladder?cancer，UBC）中表達上調，其表達水平隨著臨床分期的增加而增加。過表達circPDSS1可導致miR-16的下調，而過表達miR-16對circPDSS1無明顯影響，過表達circPDSS1可導致UBC細胞增殖、侵襲和遷移率升高，過表達miR-16不僅能抑制UBC細胞的增殖、侵襲和遷移，還能減弱過表達circPDSS1的作用。因此，circPDSS1可能通過下調miR-16促進UBC的進展[28]。

4.1.4??circZFR??circZFR在BC組織和細胞中的表達高于相鄰的非腫瘤組織和正常膀胱上皮細胞。較高的circZFR水平與BC患者的病理T分期、分級、淋巴轉移、復發、無進展生存期和總生存期呈正相關，說明circZFR可用作預后的生物標志。circZFR敲低可以顯著減弱BC細胞的遷移和侵襲能力，從機制上講，circZFR可以直接結合miR-377作為海綿，從而促進ZEB2在BC細胞中的表達[31]。

4.1.5??circPRMT5??circPRMT5的高表達與UBC患者的轉移和（或）較差的生存水平呈正相關，circPRMT5的上調充當miR-30c的海綿，調節SNAIL1/E-鈣黏蛋白途徑，通過競爭miR-30c來促進UBC細胞的上皮-間質轉化[32]。

4.1.6??circCASC15??circCASC15的表達水平與BC患者的腫瘤分期正相關，主要機制是充當miR-1224-5p海綿來激活致癌的CREB1表達，從而促進BC細胞的增殖[33]。

4.1.7??circRGNEF??circRGNEF高表達預示了BC預后不良，其與淋巴結轉移、高病理性T期和高分期相關，與低circRGNEF表達的患者相比，circRGNEF高表達與較差的總體生存率相關[34]。

4.1.8??circRIP2??研究發現，circRIP2能夠上調BC組織中TGF-β2的表達，并通過TGF-β2/Smad3蛋白途徑誘導上皮內皮細胞轉移，有效的circRIP2活性通過激活miR-1305/轉化生長因子β2/Smad3通路而誘導BC的發生發展，從而加速膀胱癌的進展[35]。

4.2??抑癌因子

4.2.1??Cdr1as??作為第1個被發現具有miRNA海綿作用的circRNA，Cdr1as在BC組織中的表達明顯低于鄰近的正常組織。Cdr1as表達上調，在體外能抑制BC細胞的生長、侵襲和遷移，在體內能抑制腫瘤的生長。Cdr1as能使BC中的多個miRNA發生海綿化，并通過與miR-135a結合來控制BC細胞的生長、浸潤和遷移，進而起到抗腫瘤效果[36]。

4.2.2??circHIPK3??又稱為膀胱癌相關的環形RNA-2，在BC中表達下調，與腫瘤分級、侵襲程度及淋巴結轉移呈相反的變化，circHIPK3通過靶向miR-558抑制乙酰肝素酶的表達，從而抑制BC細胞的侵襲和轉移[37]。

4.2.3??circFNDC3B??在人類BC組織中，circFNDC3B的表達明顯減少，并且與病理T分期、分級、淋巴侵犯程度以及患者的總存活率密切相關。在體外和體內，過表達的circFNDC3B在功能方面都明顯抑制了細胞的生長、遷移和侵襲。circFNDC3B作為miR-1178-3p海綿，抑制癌基因G3BP應激顆粒組裝因子2，從而抑制與G3BP2基因相對應的SRC/FAK信號通路，circFNDC3B的過表達可以通過靶向miR-1178-3p/G3BP2/SRC/FAK軸來有效控制體外細胞生長和侵襲，并在體內控制癌細胞增殖和淋巴結轉移，表明circFNDC3B可成為一個全新的癌癥抑制因子和藥物靶點[38]。

4.2.4??circITCH??circITCH在BC組織中表現下調，circ-ITCH低表達的BC患者生存期減少。circITCH的強制表達可抑制細胞在體內外的生長、遷移、侵襲和轉移。circITCH通過作為miR-17和miR-224的分子海綿，使miR-17的靶基因p21表現上調，miR-224靶基因PTEN的表現上調，進而抑制BC的侵襲性生物學行為[39]。

4.2.5??circLPAR1??circLPAR1在MIBC組織中表達下調。相比于表達上調患者，circLPAR1表達下調的患者特異性生存期更短。circLPAR1可以與miR-762結合并抑制其作為miRNA海綿的活性，即circLPAR1在miR-762的侵襲和轉移中起關鍵作用[40]。

5??小結與展望

circRNA是BC進程中的重要因素，circRNA為BC的診斷、預后和治療提供了新的視角。多種circRNAs在BC組織中有差異表達，且其功能失調程度與BC患者的臨床病理特征直接相關。circRNA具有高度穩定性、高豐度及在不同體液中的廣泛分布的特點，既是有前景的治療和預后生物標志，也是BC的潛在治療靶標。盡管在circRNA研究領域已取得了許多進步，但仍有許多局限性。首先，circRNA的生物發生、更新、作用機制和功能尚不清楚，與功能未知的大量circRNA相比，僅驗證了少數circRNA的功能。其次，circRNA在組織細胞中的特異性表達是怎樣被調控的，目前還不明確，需要進一步的驗證。最后，大多數研究的樣本量很小，通常缺乏不同組織學等級和病理學階段的表達譜，而且統一規范的circRNA命名系統也應該盡快被建立起來。

綜上所述，由于circRNA的產生過程和功能更加豐富了真核生物轉錄組的復雜性與多樣性，充實了后基因組時代的研究內容，因此，對這類非編碼RNA的研究具有潛在的治療和研究應用價值，但circRNA領域的研究仍處于起步階段，今后仍需做大量的研究。

[參考文獻][1] National?Health?Commission?of?the?Peoples?Republic?of?China.?Chinese?guidelines?for?diagnosis?and?treatment?of?urothelial?carcinoma?of?bladder?2018?（English?version）[J].?Chin?J?Cancer?Res，?2019，?31（1）：?49–66.

[9] LIANG?D，?TATOMER?D?C，?LUO?Z，?et?al.?The?output?of?protein-coding?genes?shifts?to?circular?RNAs?when?the?pre-mRNA?processing?machinery?is?limiting[J].?Mol?Cell，?2017，?68（5）：?940–954.?e3.

[16] ABDELMOHSEN?K，?PANDA?A?C，?MUNK?R，?et?al.?Identification?of?HuR?target?circular?RNAs?uncovers?suppression?of?PABPN1?translation?by?circPABPN1[J].?RNA?Biol，?2017，?14（3）：?361–369.

[24] ABE?N，?MATSUMOTO?K，?NISHIHARA?M，?et?al.?Rolling?circle?translation?of?circular?RNA?in?living?human?cells[J].?Sci?Rep，?2015，?5：?16435.

[33] ZHUANG?C，?HUANG?X，?YU?J，?et?al.?Circular?RNA?hsa_circ_0075828?promotes?bladder?cancer?cell?proliferation?through?activation?of?CREB1[J].?BMB?Rep，?2020，?53（2）：?82–87.