類風濕關節炎患者外周血TFH細胞TIGIT和PD1表達及意義

黃自坤,張 露,李 雪,羅 清

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性炎癥性自身免疫病,其主要特點是不可逆的骨關節炎癥和破壞,其病因比較復雜,與遺傳、環境和感染等多種因素有關[1]。雖然RA致病機制還不是很明確,但研究表明濾泡輔助性T細胞(follicular helper T, TFH)在RA致病性自身抗體的產生、病情緩解及進展中發揮重要作用[2],尤其是程序性死亡分子(programmed cell death 1, PD1)+TFH[3-4]。近年來,含T細胞免疫球蛋白和酪氨酸免疫抑制受體結構域蛋白(T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)在TFH上的表達受到極大的關注[5-6]。研究顯示RA患者TFH細胞也可檢測到TIGIT的表達[3],但TIGIT+TFH細胞在RA中的具體作用還不清楚。作為兩種主要的負性共刺激分子,TIGIT和PD1在RA患者免疫細胞中共表達模式所呈現的作用還不清楚。而近期,有研究表明共表達PD1和TIGIT的CD8+T細胞與其功能調控[7]和抗PD1免疫治療反應[8]有關。且有研究證實在外周血中存在一群共表達的TIGIT和PD1的TFH細胞[6]。然而,關于RA患者TFH細胞上TIGIT和PD1的共表達情況,以及相關的臨床意義還鮮為報道。該研究通過檢測RA患者和健康對照者外周血TFH細胞TIGIT和PD1的表達情況,系統性分析TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞水平與疾病炎癥程度、活動性以及自身抗體的關系,以期探討不同共刺激分子表達的TFH在RA發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2017年10月—2019年9月于南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科就診的RA患者79例(RA組),其中女性55例,男性24例,年齡17～81(57.8±12.3)歲。所有患者RA都符合美國風濕病學會(ACR)制定的RA診斷標準[9],并排除其他嚴重疾病。選取對照者45例(HC組),為年齡和性別相匹配的健康體檢者,其中女性27例,男性18例,年齡29～82(53.7±14.3)歲。詳細收集RA患者臨床資料及相關實驗室檢查結果,進行RA疾病活動性評分(disease activity score 28, DAS28)[10]。本實驗經過醫院倫理委員會批準[編號:(2022)CDYFYYLK(06-004)],參加者均知情同意。

1.2 儀器與試劑流式細胞抗體藻紅蛋白標記的TIGIT抗體(phycoerythrin-TIGIT, PE-TIGIT)、異硫氰酸熒光素標記的PD1抗體(fluorescein isothiocyanate-PD1,FITC-PD1)、PC7標記的CXCR5抗體(PC7-CXCR5)購自美國eBioscience公司;藻紅蛋白-得克薩斯紅標記的CD4抗體(phycoerythrin-texas red,ECD-CD4)及相應的同型對照PE-IgGl和FITC-IgG1均購自美國Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品,分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統;外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)Ficoll-Paque分離液購自美國Sigma公司。

1.3 PBMC提取肘前靜脈采集EDTA抗凝外周血5 ml,6 h內送檢。采用PBMCFicoll-Paque分離液提取RA患者和對照者的PBMC。

1.4 流式細胞術檢測單核細胞表面分子各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的PBMC加入2個試管中,按以下組合加入單克隆抗體各10 μl:ECD-CD4、PC7-CXCR5、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD4、PC7-CXCR5、PE-TIGIT、FITC-PD1。4 ℃避光孵育30 min,如有紅細胞,則用紅細胞裂解液處理后,生理鹽水洗滌,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,重懸后用Cytomics FC 500流式細胞儀檢測分析,使用CXP分析軟件分析CXCR5+CD4+TFH細胞TIGIT和PD1的表達。

1.5 RA的其他實驗室指標檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)采用動態血沉儀法(北京普利生公司);類風濕因子(rheumatoid factor,RF)和C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)采用速率散色比濁法(美國Beckman Coulter公司);抗環瓜氨酸多肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶聯免疫吸附法(上海科新生物技術股份有限公司);血常規采用XN-10型儀器(日本Sysmex公司)進行檢測。

2 結果

2.1 RA組和HC組外周血TFH細胞TIGIT和PD1表達水平的比較RA組TIGIT+TFH細胞百分率、TIGIT+TFH細胞TIGIT表達平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)與HC組比較差異無統計學意義。RA組PD1+TFH細胞百分率(U=1 196,P=0.002 5)、PD1+TFH細胞PD1表達MFI(U=1 134,P=0.000 8)高于HC組,差異有統計學意義。見圖1。

圖1 RA組與HC組外周血TFH細胞TIGIT和PD1表達水平

2.2 RA組與HC組外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH細胞水平的比較TFH細胞可根據TIGIT和PD1的表達分為三群:TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH細胞。RA組TIGIT+PD1-TFH細胞百分率(U=1 112,P=0.000 5)低于HC組,TIGIT+PD1+TFH細胞百分率(U=1 319,P=0.017 3)和TIGIT-PD1+TFH細胞百分率(U=1 354,P=0.027 0)均高于HC組;RA組TIGIT+PD1-TFH細胞TIGIT表達MFI(t=0.594,P=0.553 6)、TIGIT+PD1+TFH細胞TIGIT表達MFI(t=0.146,P=0.884 0)與HC組差異無統計學意義,而RA組TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI(U=920,P<0.000 1)、TIGIT-PD1+TFH細胞PD1表達MFI(U=1 177,P=0.001 8)均高于HC組。此外,RA組(U=744,P<0.000 1)和HC組(U=181,P<0.000 1)中TIGIT+PD1+TFH細胞TIGIT表達MFI均高于TIGIT+PD1-TFH細胞,RA組(t=3.99 0,P=0.000 1)和HC組(U=399,P=0.000 1)中TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI均高于TIGIT-PD1+TFH細胞。見圖2。

2.3 RA組外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞水平與自身抗體的關系RA患者血清中可以出現特異性的RF、ACPA等自身抗體,將其與TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH細胞水平進行相關性分析。結果顯示,RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI與RF呈正相關(rs=0.317 6,P=0.007 4);TIGIT-PD1+TFH細胞百分率、TIGIT-PD1+TFH細胞PD1表達MFI、TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI與陽性的RF(rs=0.311 0,P=0.019 7;rs=0.278 8,P=0.037 4;rs=0.461 5,P=0.000 3)呈正相關,TIGIT+PD1-TFH與RF不存在相關性。此外,本文也顯示TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH和TIGIT-PD1+TFH細胞與ACPA抗體不存在相關性。

2.4 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞與炎癥指標的關系反映RA炎癥程度的相關指標包括白細胞數量(white blood cell count,WBC)、淋巴細胞數量(lymphocyte count,Lym)、淋巴細胞比例(lymphocyte percentage,Lym%)、單核細胞數量、單核細胞比例、中性粒細胞數量(neutrophil count,Net)、中性粒細胞百分比(neutrophil percentage,Net%)、淋巴細胞與單核細胞比值、中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil- to-lymphocyte ratio,NLR)、血小板與淋巴細胞比值、系統性免疫炎癥指數(systemic immune inflammation,SII)、衍生中性粒細胞與淋巴細胞比值(derived Neutrophil to lymphocyte ratio,dNLR)、ESR、CRP,將這些相關指標與外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞進行相關性分析。結果顯示,RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH細胞百分率與ESR(rs=-0.259 3,P=0.021 9)呈負相關,TIGIT-PD1+TFH細胞百分率與ESR(rs=0.239 6,P=0.034 6)呈正相關,TIGIT+PD1+TFH細胞百分率與Lym(rs=-0.265 9,P=0.018 5)呈負相關,但并未顯示TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞百分率與其他炎癥指標存在明顯相關性。進一步分析RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞PD1表達MFI與炎癥指標關系,結果顯示,TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI與Lym%(rs=-0.291 8,P=0.009 1)呈負相關,與Net(rs=0.245 5,P=0.030 3)、Net%(rs=0.285 3,P=0.010 8)、NLR(rs=0.300 9,P=0.007 4)、SII(rs=0.295 9,P=0.008 5)、dNLR(rs=0.268 7,P=0.017 4)、ESR(rs=0.374 1,P=0.000 7)、CRP(rs=0.404 7,P=0.000 2)呈正相關,RA患者外周血TIGIT-PD1+TFH細胞PD1表達MFI與N(rs=0.226 9,P=0.045 8)、ESR(rs=0.295 6,P=0.008 6)、CRP(rs=0.368 3,P=0.000 9)呈正相關。

2.5 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞與疾病活動性的關系分析RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH與RA患者DAS28-ESR、DAS28-CRP、關節疼痛數(pain joint count,PJC)、關節腫脹數(swollen joint count,SJC)、視覺模擬評分(visual analogue scale,VAS)等疾病活動性指標的關系,結果顯示:RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH細胞百分率與DAS-ESR(rs=-0.284 5,P=0.020 6)呈負相關,并未發現與其他疾病活動性指標相關;RA患者外周血TIGIT+PD1+TFH細胞PD1表達MFI與DAS28-ESR(rs=0.455 0,P=0.000 1)、DAS28-CRP(rs=0.388 0,P=0.001 3)、PJC(rs=0.331 1,P=0.006 6)、SJC(rs=0.337 2,P=0.005 6)、VAS(rs=0.353 8,P=0.003 3)呈正相關;RA患者外周血TIGIT-PD1+TFH細胞PD1表達MFI與DAS28-ESR(rs=0.369 2,P=0.002 3)、DAS28-CRP(rs=0.365 7,P=0.002 5)、PJC(rs=0.354 6,P=0.003 5)、SJC(rs=0.299 6,P=0.014 5)、VAS(rs=0.266 1,P=0.029 5)呈正相關。

2.6 RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH細胞水平與RA危險因素關系采用單因素和多因素(強迫引入法)分析TIGIT+PD1-TFH、TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH是否為RA的危險因素,結果顯示降低的TIGIT+PD1-TFH細胞百分率和升高的TIGIT+PD1+TFH細胞百分率為RA發病危險因素。見表1。

3 討論

TFH是近年來發現的一種特殊類型、具有促進B細胞成熟、轉化為漿細胞以及誘導抗體產生能力的CD4+T細胞亞群。Piantoni et al[11]研究發現RA患者TFH細胞上表達高水平的誘導T細胞共刺激因子(ICOS)。有研究[12]表明CD28等共刺激分子也可表達于RA患者的TFH細胞中。此外,Cao et al[13]和Aldridge et al[4]發現RA患者TFH細胞PD1表達升高,升高的PD1+TFH細胞與RA患者的炎癥水平和致病性抗體相關,且可作為預測疾病治療后是否緩解的指標,這與本研究檢測到的RA患者外周血中總PD1+TFH細胞水平明顯高于對照者是相一致的。

近年來,TIGIT分子在對固有免疫細胞以及適應性免疫細胞的調節方面受到了重視。現有數據表明TIGIT可表達于TFH細胞中,并可調控TFH細胞功能,如Godefroy et al[6]發現TIGIT+TFH細胞在調控鐮刀性貧血患者發生輸血免疫反應中起著關鍵作用,雖然總的TIGIT+TFH細胞水平在疾病組與對照組間無差異;Akiyama et al[14]研究表明IgG4相關性疾病患者外周血的TIGIT+TFH細胞水平明顯升高,且與IgG4相關性疾病的活動性及治療療效密切相關。近期的研究[3]結果顯示RA患者PD1+TFH細胞上也可檢測到TIGIT分子表達,提示TIGIT可能參與RA的發病過程,但其具體作用尚不明確。本研究采用流式細胞術檢測79例RA患者和45例對照組外周血TFH細胞中TIGIT表達水平,結果顯示兩組總的TIGIT+TFH細胞百分率和TFH細胞的TIGIT表達MFI無差異,這些研究結果與其他人員關于TIGIT+TFH細胞水平在系統性紅斑狼瘡[15]、鐮刀性貧血患者[6]與對照組中無差異的研究結果是相一致,但是不同于Akiyama et al[14]關于TIGIT+TFH細胞在IgG4相關性疾病患者中的分布。這些研究表明TIGIT+TFH細胞在不同免疫疾病中的含量及所執行的功能可能有所不同。

免疫細胞上TIGIT和PD1的共表達受到越來越多的關注[6-8],這些研究結果顯示TIGIT和PD1在T細胞上的共表達與疾病臨床結果和細胞功能調控有關。本研究結果表明TIGIT+PD1+TFH細胞、TIGIT-PD1+TFH細胞水平與疾病嚴重程度成正相關,患者疾病越嚴重,TIGIT+PD1+TFH細胞、TIGIT-PD1+TFH細胞水平越高。且TIGIT+PD1+TFH細胞、TIGIT-PD1+TFH細胞水平與自身抗體RF水平呈正相關。這些與近期對其他免疫相關性疾病的研究結果一致[14]。另外,TIGIT+PD1+TFH細胞與這些指標相關性的相關系數要高于TIGIT-PD1+TFH細胞,這與TIGIT和PD1雙陽的TFH細胞其促進B細胞轉化和抗體產生的能力明顯高于共刺激分子單陽的TFH[6]是相符合的,提示TFH細胞上共表達的TIGIT和PD1具有協同作用。進一步邏輯回歸分析也顯示升高的TIGIT+PD1+TFH細胞是RA發病的危險因素,而升高的TIGIT-PD1+TFH細胞不是。這些結果表明TIGIT+PD1+TFH促進致病性自身抗體產生在RA發生發展中發揮重要作用。

研究表明TIGIT+PD1-TFH細胞是一群能促進B細胞活化和分化的功能性細胞[6]。本研究結果顯示RA患者外周血TIGIT+PD1-TFH細胞水平降低,且TIGIT+PD1-TFH細胞水平越低,RA患者的疾病炎癥程度和嚴重程度越高,患病越嚴重;而之前也有研究[16]證實RA患者外周血T細胞上負性共刺激分子TIGIT的表達水平降低,且與疾病活動性呈負相關。此外,本研究并未發現RA患者外周血中TIGIT+PD1-TFH細胞水平與自身抗體存在相關性,提示RA患者中TIGIT+PD1-TFH細胞可能是一群功能不同于之前研究[5]報道的細胞,RA患者中這群細胞并不是通過促進B細胞轉化和抗體產生參與RA致病。進一步邏輯回歸分析顯示降低的TIGIT+PD1-TFH細胞水平是RA發病的危險因素,表明TIGIT+PD1-TFH在RA致病中呈現保護性作用。這些研究結果亦表明RA患者TIGIT+PD1-TFH細胞可能以不同于TIGIT+/-PD1+TFH細胞作用方式參與RA的發生發展,但其具體作用方式及機制還有待于進一步探索。

綜上所述,RA患者外周血升高的TIGIT+PD1+TFH、TIGIT-PD1+TFH細胞水平與疾病的抗體產生、炎癥程度及活動性有關;降低的TIGIT+PD1-TFH細胞水平與疾病的炎癥程度及活動性有關。今后尚需進一步探討TIGIT在TFH細胞及RA發生發展中作用及其機制,以期為RA治療提供新靶點。