SPARCL1基因多態性與動脈粥樣硬化遺傳易感相關性分析

陳心嚴,程 煦,陳婷婷,王 華,張 敏,朱華慶,程筱雯

全球疾病負擔報告[1]顯示,由動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)引起的心腦血管疾病是現代社會威脅人類健康的首要原因。AS的發生原因較復雜,包括環境和遺傳因素等[2-4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)構成90%以上人類基因組遺傳變異,目前已發現很多與AS有關聯的易感基因位點[5]。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteine-like 1,SPARCL1)是一種胞外基質蛋白,具有抗黏附、參與細胞增殖和遷移的功能[6]。相同的組織中,SPARCL1在疾病狀況下表達有所變化。SPARCL1在前列腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌等多種癌癥中表達下調,認為SPARCL1可能有抑癌作用[7-10]。目前尚未見SPARCL1與AS關系的文獻報道,也鮮有關于SPARCL1基因多態性的研究。該研究擬通過病例對照研究,分析SPARCL1在AS患者和健康對照者中的表達情況及SPARCL1的SNP位點(rs7695558和rs1049539)與AS的相關性,探討SPARCL1在AS發生發展過程中的可能作用,為AS的診療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫科大學第一附屬醫院2019年12月—2020年6月收治的209例AS患者為研究對象,同一時期的208例健康體檢者為對照組。隨機選擇其中51例AS患者和年齡性別相匹配的50例健康體檢者的全血用于提取DNA。后續免疫組化實驗所用冠狀動脈組織源自安徽醫科大學第一附屬醫院病理中心的臨床解剖組織標本(10例)。所有AS的診斷均經臨床確立。對照組經臨床檢查排除心腦血管疾病,且肝腎功能正常,與病例組年齡、性別相匹配。本研究所選取的研究對象與健康體檢者均來自安徽省。

1.2 方法

1.2.1標本采集與DNA提取 采集空腹靜脈血,全血用于提取DNA,促凝血離心分離后收集的血清用于酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。嚴格按照試劑盒的說明書,從全血標本中提取基因組DNA。使用NanoDrop one(美國Thermo公司)檢測DNA含量,樣品DNA的A260/A280在1.8～2.0之間時,認為已達到所要求的純度。

1.2.2ELISA試驗 嚴格按照人SPARCL1酶聯免疫分析試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)的說明書操作。酶標板設置標準品孔、樣本孔、空白孔(樣本孔設置3個復孔),經加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、測定等步驟后,用酶標儀讀取各孔吸光度值,計算樣品濃度。

1.2.3免疫組織化學 3 μm厚的石蠟組織切片經65 ℃烤片2 h后脫蠟水化,并在檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 6.0)中微波加熱以修復抗原。然后加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑室溫阻斷10 min,用PBS緩沖液沖洗3 min×3次,然后將切片與多克隆抗SPARCL1抗體(proteintech,武漢三鷹生物技術有限公司)以1 ∶200的稀釋度在37 ℃溫箱孵育1 h,PBS緩沖液沖洗3 min×3次,再滴加酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育20 min,PBS緩沖液沖洗3 min×3次,最后進行顯色反應。

1.2.4SNP基因分型 在LightCycler480 熒光定量PCR儀上通過高分辨率熔解曲線分析(high resolution melting,HRM)對樣本進行基因分型。PCR在96孔板中以20 μl的體積進行,包括10～150 ng的DNA,2 mmol/L的每種引物,2.5 mmol/L的MgCl2,水和LightCycler480高分辨率熔解預混液。 按照以下反應條件進行:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,45個循環;58 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s。 通過在70～97 ℃以每1 ℃ 25次采集的速率獲得HRM曲線數據。AA和TT表示野生純合基因型,AG和TC表示雜合突變基因型,GG和CC表示純合突變基因型。

2 結果

2.1 SPARCL1 在血清中的表達情況病例組和對照組年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05);但AS患者的SPARCL1血清表達水平低對照組(Z=-2.916,P=0.004)。見表1。

表1 SPARCL1在病例組和對照組中血清表達水平

2.2 SPARCL1血清水平和AS發病風險關聯的分層分析從以上AS病例人群中篩選出有AS發病風險因素數據的人群,420 ng/ml為該組人群SPARCL1血清水平的中位數,以420 ng/ml為分組切點,比較兩組研究對象的年齡、性別、心血管危險因素等指標,結果顯示SPARCL1水平與患者年齡(P=0.027)、舒張壓有關(P=0.008),與SPARCL1血清水平低的患者比較,SPARCL1水平高的患者年齡更高且舒張壓更低。見表2。

表2 SPARCL1不同水平和AS發病風險因素的組間比較

2.3 SPARCL1在血管組織中的表達情況免疫組化結果顯示,冠狀動脈組織中粥樣硬化病變部位的SPARCL1表達水平增高,以泡沫細胞表達為主。見圖1。

圖1 免疫組化檢測SPARCL1在AS患者冠狀動脈組織中的表達情況

2.4 SPARCL1基因SNP位點rs7695558、rs1049539與AS易感性的關聯性研究從209例AS患者和208例健康體檢中隨機選擇其中51例AS患者和年齡性別相匹配的50例健康體檢者,收集全血提取DNA后通過HRM對SPARCL1的兩個SNP位點rs7695558、rs1049539進行基因分型。rs7695558多態性型別為AA、AG、GG,在對照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。病例組中AA、AG、GG的發生頻率分別為17.65%、52.94%、29.41%;在對照組中,相應的數據分別為10.00%、40.00%、50.00%。經χ2檢驗,病例組和對照組關于rs7695558的基因分布的差異無統計學意義(χ2=4.676,P=0.097)。rs1049539多態性型別為TT、TC、CC,在對照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。病例組中TT、TC、CC的發生頻率分別為47.06%、47.06%、5.88%;在對照組中,相應的數據分別為52.00%、44.00%、4.00%。經χ2檢驗,病例組和對照組關于rs1049539的基因分布的差異無統計學意義(χ2=0.435,P=0.848)。對于rs7695558,在隱性遺傳模型中,含A和不含A的基因分布有差異,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS發病風險低,OR=0.417,95%CI:0.184～0.945,在10%的置信水平上顯著(P=0.034)。病例組和對照組的rs1049539,在共顯性、隱性、顯性遺傳模型差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組SPARCL1基因SNP位點rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)基因型分布情況

3 討論

AS是一種脂質驅動的慢性炎癥性疾病,其發病原因復雜,包括遺傳及環境因素[11],SNP作為第3代遺傳標記廣泛存在于各類物種中,成為個體差異化和疾病發生發展的基礎。SPARCL1基因位于人類染色體4q22～25,該基因包括11個外顯子和10個內含子[12],包含多個SNPs,其中rs7695558為內含子突變,rs1049539為外顯子突變。先前有研究[13]報道rs7695558與阿爾茲海默患者腦中SPARCL1低表達有關,表明SPARCL1在神經炎癥中有一定作用。SPARCL1在血管炎癥中是否發揮作用尚不清楚,國內外尚未報道相關文獻。SPARCL1基因的編碼產物為SPARCL1蛋白,本研究中,通過ELISA檢測發現AS患者和對照組血清的SPARCL1含量有差異,結果AS患者的SPARCL1水平低于對照組,預示SPARCL1蛋白可能有血管保護作用。隨后,以血清SPARCL1濃度420 ng/ml為分組切點,根據患者年齡、性別、心血管危險因素進行分層分析,結果表明SPARCL1水平與患者年齡、舒張壓有關,與SPARCL1血清水平低的患者比較,SPARCL1水平高的患者年齡更高且舒張壓更低,進一步表明SPARCL1可能是一種潛在的血管保護因子,但患者的性別、其他心血管危險因素與SPARCL1無明顯相關,后續實驗會擴大樣本量以及納入更多的血管危險因素進行分析。免疫組化實驗結果提示SPARCL1蛋白在AS患者冠狀動脈組織中粥樣硬化病變部位表達水平升高,主要表達在泡沫細胞。結合前述血清SPARCL1蛋白檢測結果分析,可能的原因是SPARCL1蛋白在AS發生發展過程中由于某種機制進入粥樣硬化病變部位的含量增高導致其在血清中的含量下降。

本研究中,SPARCL1的兩個SNP位點rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)在病例組和對照組中的基因分布差異均無統計學意義。在不同的遺傳模型中發現對于rs7695558,在隱形遺傳模型中,含A和不含A的基因分布有差異,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS發病風險低,OR=0.417,95%CI:0.184～0.945,在10%的置信水平上顯著。對于rs1049539,在共顯性、隱性、顯性遺傳模型中均未見病例組、對照組中的基因型分布有明顯差異。

綜上所述,本研究首次在中國安徽人群中鑒定了位于人類SPARCL1基因內含子內的與AS風險相關的新易感位點rs7695558,同時提示SPARCL1可能作為血管保護因子發揮了抗AS的作用。樣本量較小為本研究的不足,課題組后續實驗正在納入更多的血管危險因素及其他地區的人群,擴大樣本量驗證并進一步在細胞水平及模式動物水平探討SPARCL1抗AS的具體分子機制,以期評估SPARCL1成為AS診療新靶點的可能性。