直接靶板微滴法快速檢測肺炎克雷伯菌替加環素和多黏菌素的敏感性

夏兆新,楊文蘇,朱 毅,胡心益,林春暉,蔣 童,沈繼錄

肺炎克雷伯菌是重要的院內感染病原體,其耐藥性在全球范圍內不斷增加,且治療藥物愈發受限,是重大的公共衛生問題之一[1]。替加環素和多黏菌素是治療這些致病菌感染的重要藥物[2-3]。然而隨著其在臨床抗感染治療中的逐漸使用,近年來也不斷有對其耐藥的菌株被分離出來[4-5]。CHINET數據[6]顯示,2021年肺炎克雷伯菌的替加環素耐藥率為4.2%,中介率為7.0%,而多黏菌素在克雷伯菌屬中的耐藥率也達到3.9%。目前臨床上常用紙片擴散法,或基于微量肉湯稀釋法來檢測替加環素和多黏菌素的敏感性,然而其操作繁瑣,耗時長,可能會延誤治療。為了優化替加環素和多黏菌素的使用,該研究基于基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術[7-8]進行直接靶板微滴生長法(direct-on-target micro-droplet growth assay,DOT-MGA),預測替加環素和多黏菌素的敏感性,評估數小時內快速檢測肺炎克雷伯菌耐藥表型的可行性和準確性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源共收集安徽醫科大學第一附屬醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌67株,其中27株對替加環素耐藥菌,13株對多黏菌素耐藥,27株對兩種抗生素敏感。所有菌株均經過MALDI-TOF MS(德國Bruker公司)鑒定,確定菌種。

1.2 材料與試劑MALDI-TOF MS質譜儀,質譜樣品處理基質液及MALDI-TOF MS靶板均購自德國Bruker公司;替加環素、多黏菌素和CAMHB肉湯粉末(陽離子調節肉湯)購自北京索萊寶科技有限公司;哥倫比亞血瓊脂平板購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司;ATCC27853和ATCC25922作為微量肉湯稀釋法和MALDI-TOF MS鑒定所用的標準菌株,為安徽醫科大學第一附屬醫院微生物實驗室所保存。

1.3 微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)通過微量肉湯稀釋法測定替加環素的MIC。根據美國食品藥品管理局臨床折點,解釋替加環素敏感性(MIC≥8 mg/L為耐藥,MIC=4 mg/L為中介,MIC≤2 mg/L為敏感),ATCC25922作為參考菌株;根據歐洲抗菌藥敏感性試驗委員會臨床折點,解釋多黏菌素敏感性(MIC≥4 mg/L為耐藥,MIC≤2 mg/L為敏感),ATCC27853和ATCC25922作為參考菌株。

1.4 DOT-MGA在96孔微量滴定板孔中先加入100 μl菌液,后加入100 μl的MH肉湯(含或不含抗生素,其終濃度為2 μg/ml),不含抗生素的孔用作該樣品的生長對照孔。然后取6 μl混合液微滴轉移到MALDI-TOF MS靶板孔上,一式三份進行,3個孔含有抗生素,另外3個孔不含抗生素。將接種好的靶板放入塑料運輸盒中,在盒底部加入4 ml去離子水,用作濕盒。置于溫箱中于(35±1)℃分別孵育3、4、6、8 h后,使用無塵紙將肉湯從靶板上移除。待靶板上剩余菌液完全干燥后,加入1 μl基質液覆蓋靶點,手動收集MALDI-TOF質譜光譜,并由MALDI Biotyper 3軟件(Bruker Daltonik)評估。

預實驗中隨機選取13株敏感和13株耐藥的細菌,分別設置了3、4、6和8 h的孵育時間后,對所有菌株進行DOT-MGA進行檢測。

在生長對照鑒定得分≥1.7分的情況下,該組測試判定為有效。含有替加環素或多黏菌素的樣本,成功鑒定(得分≥1.7分)被解釋為非敏感(中介或耐藥)結果NS (no susceptible),而鑒定失敗(得分<1.7分)定義為敏感S (susceptible)。

1.5 數據處理DOT-MGA的最終結果分別與微量肉湯稀釋法的結果進行比較,按照如下公式計算有效率、敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及分類一致率(categorical agreement,CA)。CA即被評估方法的結果與微量肉湯稀釋法藥敏結果一致的菌株所占百分比。見表1。

表1 DOT-MGA數據處理

靈敏度=a/(a+c);特異度=d/(b+d);陽性預測值=a/(a+b);陰性預測值=d/(c+d)

2 結果

研究[7,9]報道中顯示,DOT-MGA試驗以6 μl液滴培養可以獲得最佳檢測性能。在本研究前期實驗中以4、6、8 μl作為比較,發現液滴體積過小,小于4 μl細菌生長狀態不佳,超過6 μl則容易溢出靶板孔,造成交叉污染,6 μl可以很好的固定在孔內,獲得最佳的生長狀態,于是后續實驗均采用6 μl的體積來摸索最佳孵育時間。

2.1 替加環素的DOT-MGA結果替加環素DOT-MGA預實驗結果顯示,培養3 h后,細菌生長的有效率為88.46%,CA為73.91%,細菌生長狀態不好,不能被正確檢測。而4 h后,細菌生長的有效率為100.00%,CA為96.15%,其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.31%、100.00%、100.00%、92.86%,已達到最佳狀態,隨著時間延長到6 h和8 h,檢測性能未能得到明顯的提高。擴大菌株量,對所收集到的54株菌株,以6 μl液滴,孵育4 h后,經過MALDI-TOF質譜儀檢測,與微量肉湯稀釋法對比后,只有1株菌存在中介判斷為敏感,存在微小誤差,其他結果均一致。DOT-MGA的有效率、CA、靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為100.00%、98.15%、96.30%、100.00%、100.00%、96.45%,與微量肉湯稀釋法的結果具有良好的一致性。見表2。

表2 DOT-MG對替加環素非敏感菌株的鑒定性能

2.2 多黏菌素的DOT-MGA結果本研究共收集到13株多黏菌素不敏感的菌株,又隨機選取了13株多黏菌素敏感的菌株進行DOT-MGA實驗,在3 h孵育時間下生長有效率為92.15%,而4、6、8 h孵育時間下,生長對照孔均能有效鑒定出,生長有效率為100.00%,而在孵育4 h后,DOT-MGA的鑒定性能達到最佳,其CA、靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為96.15%、92.31%、100.00%、100.00%、92.86%,孵育時間延長到6 h和8 h,檢測性能與4 h的結果一致。見表3。

表3 靶板微滴生長法對多黏菌素非敏感菌株的鑒定性能

3 討論

目前,微量肉湯稀釋法是抗菌藥物敏感性實驗的金標準[10]。臨床常用的VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統是基于該方法進行藥物MIC值的檢測,但其結果通常不能在同一天內獲得,從而可能延誤有效的治療,微生物的快速藥敏檢測仍然是急需解決的問題。DOT-MGA是基于微量肉湯稀釋法原理,利用MALDI-TOF MS儀器具有更高的檢測性能,縮短常規肉湯稀釋法的孵育時間,從而達到快速檢測的效果,且與肉眼觀察結果比較,既可以排除主觀因素的干擾,也可以提高其準確性和靈敏度,這一方法受到了人們的廣泛關注[11-14]。有學者將美羅培南與肺炎克雷伯菌和腸桿菌共同孵育,利用DOT-MGA在4 h內實現快速檢出該菌對碳青霉烯酶的非敏感性和碳青霉烯酶的分型[15-16]。本研究收集了臨床分離的27株替加環素不敏感的菌株和13株多黏菌素不敏感的菌株,探究DOT-MGA對替加環素和多黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌的表型檢測性能。結果顯示,在與替加環素、多黏菌素共同孵育4 h后,大部分肺炎克雷伯菌便可以被MALDI-TOF MS儀檢測出,其抗生素敏感性的結果與肉湯稀釋法相比具有較高的一致性,替加環素和多黏菌素的生長有效率均為100.00%,CA分別為98.15%和96.15%。在替加環素DOT-MGA實驗中,54株菌中有1株菌(MIC=4 μg/ml,I)由中介誤判為敏感,存在微小誤差,多黏菌素DOT-MGA實驗中,26株菌有1株菌(MIC=4 μg/ml,R)由耐藥誤判為敏感,存在非常重大誤差,這可能是因為該菌MIC值與選取的折點藥物濃度相近(2 μg/ml),而配置過程中存在認為誤差引起。

DOT-MGA也同樣可以推廣到許多不同的微生物和抗生素檢測中,Idelevich et al[17]評估了DOT-MGA檢測頭孢呋辛、厄他培南、環丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素等多種抗生素的性能。但DOT-MGA檢測需要優化抗生素-生物體組合條件,摸索最適孵育時間以獲得最佳檢測性能。在本研究中,孵育時間為3 h時,部分細菌生長控制無法檢測出,這可能是孵育時間過短,細菌含量低,細菌黏液性高,從而光譜較差,儀器無法檢測出。而無抗生素孵育組,盡管生長控制孔已達到了儀器的檢測限,但加藥后偶爾也有幾個替加環素或多黏菌素耐藥的菌株生長仍未達到檢測要求,這主要與微生物自身的生長狀況有關,生長緩慢的細菌需要更長的時間來與抗生素競爭,而過長的孵育時間也會導致細菌過度生長,并可能產生其他雜菌,從而無法做出準確的判斷。適當的孵育時間應允許可以成功檢測的細菌生長控制,同時可以準確表征細菌對抗生素的易感性。本研究中替加環素DOT-MGA組,有一株菌在兩次4 h孵育鑒定中,一次未檢出,一次可以正確預測,這個誤差可能受操作過程中吸水紙吸取液滴不當或靶板清潔程度等多種因素的影響。因此,在摸索多種抗生素-細菌組合的最佳檢測條件后,開發出一種含有固定含量抗生素的一次性靶板,改進棄去液滴的方式,規范操作流程,從而減小實驗中的誤差,更好用于臨床藥物敏感性的檢測。

本研究僅對替加環素和多黏菌素這兩種藥物進行評估,研究表明DOT-MGA法可以在4 h孵育后檢測對替加環素、多黏菌素敏感和不敏感的菌株,未對其他抗生素進行評估,但其他抗生素尤其是碳青霉烯類藥物的檢測先前已有報道,Idelevich et al驗證了多種抗生素在孵育4 h后便可獲得最佳檢測性能[17]。替加環素、多黏菌素耐藥的菌株難以收集,實驗中的菌株量有限,仍需擴大樣本量和細菌種類進一步驗證。其中Horseman et al[11]的研究也表明DOT-MGA法在金黃色葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌四種常見病原菌的藥敏鑒定中同樣具有很高的準確性。DOT-MGA方法在其他不同菌種的藥物敏感性檢測中可能也具有很大的潛能。

綜上所述,DOT-MGA方法可以快速鑒別替加環素和多黏菌素的敏感性,并可能用于不同菌種、不同抗生素敏感性的鑒別,這為臨床微生物抗生素快速檢測提供新的思路,對臨床多重耐藥菌的抗感染治療具有重大意義。