QDPR通過調控Beclin1改善UUO誘導的大鼠腎間質纖維化

高海洋,何海蘭,張立國,陳 曦,李治國

腎間質纖維化是許多進行性慢性腎臟疾病的共同途徑,最終導致終末期腎衰竭,其發病機制十分復雜,主要特征是細胞外基質沉積、成纖維細胞積累、炎性細胞浸潤等[1-3],目前缺乏有效治療方法。因此,探討腎間質纖維化的發病機制,對于預防和減輕腎間質纖維化具有重要意義。醌型二氫生物喋呤還原酶(quinoid dihydropteridine reductase,QDPR)在體外研究中發現有抗纖維化作用,過表達QDPR能減少轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達[4],提示其在腎間質纖維化中有重要作用。據報道,QDPR這一作用可能與自噬相關[5]。自噬是一種高度保守的細胞行為[6],其在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型腎纖維化過程中起到雙重作用[7-9]。自噬誘導腎小管萎縮和分解,從而促進纖維化[9],又可能通過抑制上皮間質轉化進而抑制纖維化[8]。此外,研究[10]發現Beclin1是自噬過程的關鍵調節因子之一。因此,該研究擬通過構建過表達QDPR的UUO模型,探討QDPR是否通過調控Beclin1的表達進而調控腎間質纖維化,為腎間質纖維化發病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑慢病毒由華北理工大學李治國教授課題組自制;QDPR抗體、α-SMA抗體(美國Proteintech公司);COL Ⅰ(武漢博士德生物工程有限公司);E-Cadherin (ECa)抗體、Beclin1抗體(美國Proteintech公司);山羊抗兔抗體(英國Abcam公司);枸櫞酸三鈉、檸檬酸(天津大茂化學試劑廠);DAB(德國Sigma公司);Masson染色試劑盒(珠海貝索生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物3周齡,雄性健康清潔(SPF)級的SD 大鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物的生產許可證號:SYXK(京)2015-0017]24只,體質量(237±13)g,置于北京中日友好醫院醫學動物實驗動物房飼養[合格證號:SYXK(京)2005-0019;倫理審批單位:華北理工大學;動物實驗研究的倫理審批號:LAEC-NCST-2017015]。動物模型的制備:① UUO模型組(U組):結扎大鼠左側的輸尿管兩端,并剪斷中間的輸尿管;② 假手術組(S組):與UUO模型組方法相同,唯一區別是只分離左側輸尿管,并不結扎及剪斷;③ UUO+QDPR空載組(C組):與UUO模型組方法相同,區別是在分離左側輸尿管后,沿著輸尿管逆行注射病毒滴度為1.0×107U過表達QDPR空載慢病毒50 μl,然后用絲線結扎注射口的上方防止病毒流下,結扎輸尿管兩端,剪斷中間的輸尿管;④UUO+QDPR過表達組(Q組):與UUO+QDPR空載組方法相同,唯一區別為注射的病毒是過表達QDPR的慢病毒。造模后常規飼養,分別在7、14 d每組各處死3只。

1.3 免疫組化與Masson染色造模7、14 d后,取大鼠左側腎臟做石蠟切片,然后進行免疫組化及Masson染色,最后在400倍的顯微鏡下觀察,隨機選10個不重復的視野,用Image J分析。

1.4 Western blot檢測Western blot分別檢測α-SMA、QDPR、ECa和Beclin1的表達水平。取大鼠左側腎組織,液氮研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白。Bradford法測定蛋白濃度,統一稀釋到3 000 μg/ml,通過SDS-PAGE電泳每組跑15 μg蛋白,半干轉到NC膜,5%牛奶室溫封閉2 h,一抗[α-SMA(1 ∶1 000)、QDPR(1 ∶1 000)、ECa(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)]室溫孵育2 h,TBST洗膜,二抗(山羊抗兔1 ∶3 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,最后顯影,使用Image J分析條帶的灰度值,然后計算各蛋白目的條帶與內參的比值。

2 結果

2.1 UUO模型存在腎臟纖維化單側輸尿管結扎構建UUO模型(見圖1),通過Masson和COL Ⅰ染色以及Western blot檢測纖維化因子ECa和α-SMA的表達情況。Masson染色結果顯示:UUO模型7 d組(U7)中的膠原纖維高于S模型7 d組(S7)(t=-19.596,P<0.001),UUO模型14 d組(U14)中的膠原纖維高于S模型14 d組(S14)(t=-6.552,P<0.001);COL Ⅰ染色顯示:U7組中的COL Ⅰ的含量高于S7組(t=-11.351,P<0.001),U14組中的COL Ⅰ的含量高于S14組(t=-4.939,P<0.01);且,與S7組比較,U7組中ECa含量降低(t=7.387,P<0.05),α-SMA含量升高(t=-3.058,P<0.05);與S14組比較,U14組中ECa含量降低(t=7.866,P<0.01),α-SMA含量升高(t=-7.98,P<0.01)。見圖2。

圖2 Masson和COL Ⅰ染色以及Western blot檢測UUO模型中的纖維化水平

2.2 UUO模型中QDPR表達腎臟免疫組化和Western blot檢測了QDPR的表達情況。免疫組化結果顯示:與S7組比較,U7組中的QDPR表達水平降低(t=27.256,P<0.001);與S14組比較,U14組中的QDPR表達水平降低(t=18.499,P<0.001)。Western blot結果顯示:U7組(t=20.897,P<0.001)和U14組(t=8.301,P<0.01)中QDPR含量均低于S組。見圖3。

圖3 免疫組化染色和Western blot檢測QDPR在腎纖維化中的表達情況

2.3 過表達QDPR基因的UUO模型的構建C7組(慢病毒對照7 d組)和Q7組(QDPR慢病毒過表達7 d組)中慢病毒標簽ZsGreen均有表達;C14組(慢病毒對照14 d組)和Q14組(QDPR慢病毒過表達14 d組)組中ZsGreen亦有表達,提示慢病毒感染腎臟成功。免疫組化染色QDPR的結果顯示:與C7組比較, Q7組中QDPR的表達差異無統計學意義(t=1.105,P=0.331);而與C14比較,Q14中QDPR染色的表達面積增加(t=-34.138,P<0.001)。Western blot結果顯示:與C7組比較, Q7組中QDPR的表達差異無統計學意義(t=1.022,P=0.365);與C14比較,Q14中QDPR的表達增加(t=-7.061,P<0.01)。結果提示慢病毒在輸尿管逆行注射后7 d已有表達,但未增高,14 d過表達組中QDPR顯著增高。見圖4。

圖4 免疫組化染色和Western blot檢測QDPR模型的制備情況

2.4 過表達QDPR對UUO誘導的大鼠腎間質纖維化的影響Masson染色顯示:與C14組比較,Q14組的膠原纖維面積降低(t=6.811,P<0.01);COL Ⅰ染色顯示:與C14組比較,Q14組的COL Ⅰ染色面積降低(t=4.643,P<0.05);Western blot檢測顯示:與C14組比較,Q14組中的ECa蛋白的表達水平增高(t=-10.280,P<0.05),α-SMA表達水平降低(t=2.922,P<0.05)。見圖5。

圖5 Masson、COL Ⅰ染色和Western blot檢測過表達QDPR的UUO模型中的纖維化水平

2.5 過表達QDPR對Beclin1蛋白的表達的影響與S14比較,U14組中Beclin1蛋白的表達水平升高(t=-3.272,P<0.05);過表達QDPR后,與C14組比較,Q14組中Beclin1蛋白的表達水平降低(t=10.404,P<0.001)。見圖6。

圖6 Western blot檢測Beclin1表達水平

3 討論

腎間質纖維化是各種終末腎病發展到終末腎功能衰竭的終末途徑[11-12],已成為危害人類生命健康的公共衛生問題。深入認識腎臟纖維化的發病機制,對腎臟疾病的預防、診斷和治療具有重要的意義。

研究[4-5]發現,QDPR在體外研究中有一定的抗腎臟纖維化作用,可能與自噬密切相關。過表達QDPR基因能減少在纖維化中有重要作用的TGF-β1的表達[4],提示其在腎間質纖維化中發揮著重要的作用。本課題開展了過表達QDPR對腎間質纖維化影響的體內研究, UUO模型腎臟出現了纖維化,并且在UUO模型中發現QDPR含量降低,而與自噬密切相Beclin1的表達增高,提示QDPR和Beclin1可能在腎臟纖維化中有重要作用。為進一步研究QDPR在腎間質纖維化中的作用和機制,本研究用輸尿管逆行注射的方法,制備過表達QDPR及其空載對照UUO模型,探究過表達QDPR對腎間質纖維化的影響及其可能機制。結果顯示,C組與Q組中慢病毒標簽ZsGreen均有表達,提示模型制作成功。免疫組化染色和Western blot檢測顯示QDPR在7 d表達并未表達增加,而14 d表達明顯升高,提示慢病毒介導的基因表達需要超過1周才能充分表達。通過Masson染色及檢測抗纖維化相關因子ECa的表達水平,發現過表達QDPR可降低膠原纖維并增加ECa的表達,表明過表達QDPR可以抑制UUO模型的腎間質纖維化。

為了進一步研究QDPR抑制UUO誘導的腎間質纖維化的作用機制,本研究檢測了QDPR基因過表達的UUO模型中Beclin1的表達情況,發現過表達QDPR后Beclin1表達降低。眾所周知,Beclin1是自噬發生的關鍵分子[10,13],在腎臟纖維化的進展中扮演重要角色[7]。據報道,在UUO腎間質纖維化的發病過程中自噬增強,進而誘導腎小管萎縮和分解,從而促進纖維化[9]。本研究中也發現Beclin1蛋白在UUO模型中表達增高,與前人觀測結果一致。而過表達QDPR基因降低了Beclin1的表達,提示QDPR基因可能通過調控Beclin1的表達,進而改善腎間質纖維化。

綜上所述,UUO模型中QDPR表達降低,Beclin1表達增加,纖維化增強,而過表達QDPR可抑制UUO誘導的腎間質纖維化,過表達QDPR能降低Beclin1表達,提示QDPR基因可能通過調控Beclin1的表達進而改善腎間質纖維化。