鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其部分功能研究

姚 燕,王淑賢,吳銀翠,胡 爽,胡 穎,潘林鑫,徐 濤

核孔蛋白85(Nucleoporin 85,NUP85)是核孔復(fù)合體(Nuclear pore complex,NPC)中NUP107～160亞復(fù)合體(同義Y復(fù)合體)的9個(gè)成員之一[1]。NPC是指鑲嵌在核孔上的一種復(fù)雜結(jié)構(gòu),主要調(diào)節(jié)大分子跨核膜的運(yùn)輸。單個(gè)核孔蛋白具有基因表達(dá)調(diào)控、DNA修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用[2]。研究[3]表明,NUP85可與巨噬細(xì)胞上表達(dá)的C-C-趨化因子受體(C-C-chemokine receptor 2,CCR)2和CCR5相互作用,促進(jìn)趨化信號(hào)傳導(dǎo)。此外,NUP85還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展,并對(duì)炎癥具有一定作用[4],但具體調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。而炎癥是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素,對(duì)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞進(jìn)出腫瘤微環(huán)境具有重要作用。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子,吸引白細(xì)胞,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[4]。為進(jìn)一步研究NUP85的功能,該研究通過(guò)構(gòu)建NUP85的真核質(zhì)粒,首次探討NUP85在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中對(duì)炎癥因子(TNF-α、IL-6)的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料RAW264.7細(xì)胞株(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院保存);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Scientific公司);NUP85抗體(美國(guó)Santacruz公司);IL-6抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司);TNF-α抗體(南京巴傲得生物科技有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(蘇州新賽美生物科技有限公司);Lipofectamine 2000和Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物有限公司);質(zhì)粒抽提試劑盒、BamH I、XhoI內(nèi)切酶(美國(guó)Axygen公司);脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司);山羊抗鼠IgG/辣根酶標(biāo)記、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);ELISA(IL-6、TNF-α)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)PCR擴(kuò)增NUP85基因,構(gòu)建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達(dá)質(zhì)粒。酶切鑒定無(wú)誤后,由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度均勻種入6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。將A液(250 μl的Opti-MEM及2 μg pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒)與B液(250 μl的Opti-MEM及5 μl Lipofectamine 2000脂質(zhì)體)分別置于1.5 ml無(wú)酶EP管中靜置5 min后,將A液和B液混勻,靜置20 min后,將其置于6孔板中再補(bǔ)齊Opti-MEM培養(yǎng)基至2 ml。6 h后換液,培養(yǎng)24 h后以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為正常組:未進(jìn)行任何處理;LPS組:加100 ng/ml LPS刺激;對(duì)照組(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c組):轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒并加100 ng/ml LPS刺激;NUP85過(guò)表達(dá)組(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85組):轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒并加100 ng/ml LPS刺激。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 棄去6孔板中的培養(yǎng)基,PBS洗3遍,在蛋白裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)中裂解細(xì)胞,提出總蛋白。用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取等量的蛋白加入上樣孔,進(jìn)行SDS-PAG凝膠電泳。在恒流200 mA條件下濕轉(zhuǎn)60 min,使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,在脫脂奶粉(50 g/L)中封閉2 h后,用TBST緩沖液清洗,并在相應(yīng)的一級(jí)抗體中孵育12 h,一抗稀釋度分別為NUP85(1 ∶500),TNF-α(1 ∶1 000),IL-6(1 ∶1 000)。TBST洗3遍后,室溫孵育二抗1 h,TBST清洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影并拍照。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞按5 000個(gè)/孔的密度接種到96孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,再向每孔轉(zhuǎn)染約70 ng pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒,6 h后更換為含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,正常培養(yǎng)2 h,在避光條件下檢測(cè)每孔在450 nm處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù) 將RAW264.7細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度均勻種入6孔板內(nèi),轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒,6 h后更換為含有100 ng/ml LPS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后用PBS清洗3遍,收集所有細(xì)胞于15 ml離心管中,用400 μl Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞,再加入5 μl FITC避光孵育10～15 min,再加入10 μl PI,避光孵育5 min后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,并記錄。

1.2.6ELISA檢測(cè)炎癥因子的分泌 將RAW264.7細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度均勻種入6孔板內(nèi),轉(zhuǎn)染對(duì)照組空載體質(zhì)粒和pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒,6 h后更換為含有100 ng/ml LPS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后收集細(xì)胞上清液,使用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的分泌情況,步驟完全按照ELISA(TNF-α、IL-6)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR方法擴(kuò)增目的基因,利用Bam H I、Xho I雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1-3×Flag-c載體,并用T4 DNA連接酶連接兩產(chǎn)物,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,用抽提試劑盒提取質(zhì)粒。酶切鑒定結(jié)果顯示:pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒成功構(gòu)建,即陽(yáng)性克隆顯示在目的條帶大小對(duì)應(yīng)的區(qū)域有酶切得到的條帶對(duì)應(yīng)的克隆,如圖1所示。將陽(yáng)性克隆送至上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的酶切鑒定

2.2 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)用Western blot技術(shù)檢測(cè)將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后的NUP85蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:LPS組的NUP85的蛋白表達(dá)量高于正常組(t=7.650,P<0.01);過(guò)表達(dá)組的NUP85的蛋白表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組(t=10.28,P<0.01),表明pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒成功表達(dá),見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的蛋白表達(dá)

2.3 NUP85對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示:24 h后LPS組和轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組的細(xì)胞存活率分別為(0.74±0.08)和(0.67±0.05),過(guò)表達(dá)NUP85組的細(xì)胞存活率為(0.55±0.03),低于LPS組和轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組的細(xì)胞存活率(F=30.98,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)NUP85能夠抑制細(xì)胞的增殖,見圖3。

圖3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

2.4 NUP85對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和流式儀檢測(cè)將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示:24 h后正常組的細(xì)胞凋亡率為(6.74±0.46)%,LPS組及轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為(13.13±0.21)%和(13.40±0.47)%,而NUP85過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率為(15.78±1.05)%,高于對(duì)照組(F=75.38,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)NUP85能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,見圖4。

圖4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

2.5 NUP85在RAW264.7細(xì)胞中對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響用Western blot技術(shù)檢測(cè)將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后的IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)組中的TNF-α表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組升高(F=174.4,P<0.01);IL-6的表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組升高(F=105.3,P<0.01),表明在RAW264.7細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)NUP85促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá),見圖5。

圖5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85轉(zhuǎn)染后Western blot檢測(cè)炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)

2.6 NUP85在RAW264.7細(xì)胞中對(duì)炎癥因子分泌的影響使用ELISA方法檢測(cè)將pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后的IL-6和TNF-α蛋白分泌情況。結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)NUP85組中的TNF-α表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組升高(F=479.8,P<0.001);IL-6的表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組升高(F=216.5,P<0.001),表明在RAW264.7細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)NUP85促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌,見圖6。

圖6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85轉(zhuǎn)染后ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌

3 討論

NUP85作為NUP107～160復(fù)合體的一部分,構(gòu)成了NPC的外環(huán),參與NPC的組裝和維護(hù)[5]。NUP85是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白,在巨噬細(xì)胞中高度表達(dá),參與炎癥,并通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞影響腫瘤進(jìn)展[3]。而炎癥是腫瘤的基礎(chǔ)過(guò)程,緩解炎癥反應(yīng)對(duì)腫瘤的治療十分重要。巨噬細(xì)胞通過(guò)清除細(xì)胞碎片、緩解炎癥,在炎癥和腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。作為人體內(nèi)最重要的吞噬細(xì)胞之一,RAW264.7細(xì)胞負(fù)責(zé)攝取和消化許多微生物和組織中衰老、死亡和受損的細(xì)胞,還可以釋放一系列炎癥介質(zhì),例如TNF-α、IL-6等[7]。這些炎癥因子表達(dá)水平的變化在炎癥反應(yīng)中起著重要作用,抑制這些炎癥因子的分泌有助于炎癥的治療。在體外實(shí)驗(yàn)中,常選用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型[6]。因此,本研究在用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后,探討NUP85對(duì)炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)的影響。此外,細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)或外源信號(hào)均可觸發(fā)凋亡,細(xì)胞凋亡的改變與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[8]。而NUP85是否對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用,國(guó)內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)也研究了NUP85對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響。 雖然NUP85在人類細(xì)胞中的確切分子功能仍不清楚,但已知其能與趨化因子受體CCR2和CCR5結(jié)合調(diào)節(jié)趨化信號(hào)傳導(dǎo),在一些動(dòng)物模型中,CCR2和CCR5的阻斷已被證明可以抑制腫瘤的進(jìn)展,這使得NUP85成為一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)[9]。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,初步了解NUP85的功能。酶切鑒定顯示質(zhì)粒成功構(gòu)建,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞,Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明質(zhì)粒成功表達(dá)。CCK-8結(jié)果顯示NUP85過(guò)表達(dá)后能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的增殖。另流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NUP85對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果顯示,NUP85過(guò)表達(dá)后能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的凋亡。此外,通過(guò)向RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85質(zhì)粒建立NUP85過(guò)表達(dá)模型,研究NUP85對(duì)炎癥因子IL-6和TNF-α分泌的調(diào)節(jié)作用。Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)NUP85后,IL-6和TNF-α的表達(dá)水平上調(diào),ELISA結(jié)果進(jìn)一步表明過(guò)表達(dá)NUP85能夠促進(jìn)炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NUP85能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,并能促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌。這為今后炎癥相關(guān)疾病的治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。另有研究[10]表明,mTOR信號(hào)通路在炎癥性疾病中對(duì)炎癥具有調(diào)節(jié)作用,并能抑制部分白細(xì)胞介素炎癥因子的產(chǎn)生[11]?；谝陨衔墨I(xiàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,猜測(cè)NUP85可能通過(guò)mTOR信號(hào)通路影響炎癥因子的分泌。然而,NUP85與凋亡和炎癥之間的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。接下來(lái)課題組將對(duì)NUP85在動(dòng)物模型和臨床樣本中的潛在應(yīng)用進(jìn)行深入研究。