雙氫青蒿素抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移侵襲和血管生成擬態(tài)的初步研究

胡冰琪,周 靜,黃俊峰,陳禮文

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,轉(zhuǎn)移作為肺癌發(fā)展的關(guān)鍵階段,與70%以上的死亡有關(guān)[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特征的過程。在癌癥中,EMT與腫瘤起始、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性相關(guān)[2]。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是近年來在許多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的一種血管生成過程,涉及由腫瘤細(xì)胞組成的微血管通道的形成。因此,VM被認(rèn)為是侵襲性腫瘤血管形成的新模型,可以為腫瘤生長提供血液供應(yīng)[3]。

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的第一代衍生物,因其療效好、毒性低等特點,被用于臨床抗瘧治療[4]。近年來,研究表明雙氫青蒿素在肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[7]等多種腫瘤中起抗癌作用。但在肺癌中,DHA是否發(fā)揮抗癌效應(yīng)及其可能的抗癌機制還有待探究。該研究使用DHA處理非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549和H3255細(xì)胞來檢測對EMT過程中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和VM的標(biāo)志物VE-cadherin表達的影響,并采用一系列細(xì)胞功能實驗探討DHA對NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲和VM的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料A549、H3255細(xì)胞采購于上海富恒生物技術(shù)有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司;0.25%胰酶消化液、1%青-鏈霉素、CCK8試劑和RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;總RNA提取試劑盒購于新貝(上海)生物科技有限公司;E-Cadherin 抗體購于美國Affinity Biosciences公司;N-Cadherin 抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司;Vimentin抗體、VE-Cadherin抗體購于英國 Abcam公司;山羊抗兔(H+L) HRP和山羊抗小鼠(H+L) HRP 購于美國 Affinity Biosciences公司;Western blot顯影儀購于上海天能科技有限公司;Matrigel Matrix 基質(zhì)膠和Transwell小室購于美國 Corning公司。

1.2 實驗藥物DHA(純度>97%)購于美國Selleck公司、DMSO購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,DHA用DMSO充分溶解配成100 mmol/L的母液,水浴鍋50 ℃水浴助溶,-20 ℃保存。在實驗前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋母液至所需使用的濃度(使DMSO終體積分?jǐn)?shù)<0.1%)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 向RPMI1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素,配制成新鮮培養(yǎng)基,在5% CO2、飽和濕度條件下的37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)A549和H3255細(xì)胞。

1.3.2CCK8實驗 將A549和H3255細(xì)胞以5×103個/孔的密度鋪進96孔板中。待細(xì)胞過夜貼壁后,加入不同濃度的DHA(0、5、10、25、50、100 μmol/L)放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。到待測時間后,以1 ∶10的比例將CCK8試劑和RPMI1640培養(yǎng)基混合,將96孔板中的培養(yǎng)基吸出,加入配好的溶液,1 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.3Transwell實驗 Matrigel Matrix基質(zhì)膠和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1 ∶3的比例配置。向小室內(nèi)加入 60 μl所配制的基質(zhì)膠溶液,置于 37 ℃培養(yǎng)箱烘干。其中,僅侵襲實驗需使用含基質(zhì)膠的無血清溶液,遷移實驗無需基質(zhì)膠。細(xì)胞數(shù)量為:遷移實驗每小室 5×104個,侵襲實驗每小室 1×105個。向小室的下室加入600 μl含30%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基,放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入4%多聚甲醛細(xì)胞固定液,0.1%結(jié)晶紫溶液染色。觀察結(jié)果并拍照。

1.3.4三維細(xì)胞培養(yǎng) 將Matrigel Matrix 基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基1 ∶1配置,向96孔板每孔加入配置好的含基質(zhì)膠培養(yǎng)基溶液50 μl,放置37 ℃培養(yǎng)箱烘干1 h。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入5×105個/ml細(xì)胞,終體積為 100 μl的細(xì)胞懸液。然后將96孔板放至37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～12 h。最后將 96 孔板置于倒置顯微鏡觀察高倍鏡視野下,觀察孔內(nèi)外細(xì)胞的血管樣形態(tài)生成情況并拍照記錄。實驗重復(fù)3次。

1.3.5RNA提取與qRT-PCR實驗 總RNA按廠家說明書用TRIzol試劑提取,然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,qRT-PCR檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、VE-cadherin和內(nèi)參GAPDH的表達水平,引物序列見表1,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s。

表1 引物序列

1.3.6Western blot實驗 加入RIPA裂解液收集細(xì)胞上清,進行SDS-PAGE蛋白電泳后,將蛋白質(zhì)信息轉(zhuǎn)移至PVDF膜(0.45 μm)上,切膜后,將條帶放入5%脫脂牛奶中封閉2 h。一抗E-cadherin(兔源單抗1 ∶2 000稀釋)、N-cadherin(兔源單抗1 ∶1 000稀釋)、 Vimentin(兔源單抗1 ∶3 000稀釋)和VE-cadherin(兔源單抗1 ∶1 000稀釋),GAPDH(兔源多抗1 ∶5 000稀釋),4 ℃冰箱里過夜;HRP二抗(1 ∶5 000稀釋)37 ℃孵育1.5 h,置于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影,用Image J圖像分析軟件對各組蛋白條帶進行灰度值測定,實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 DHA抑制A549和H3255細(xì)胞的生長在96孔板中鋪細(xì)胞后,加入不同濃度的DHA(0、5、10、25、50、100 μmol/L),分別處理24、48、72 h后,加入CCK8溶液進行檢測。與對照組(DHA濃度為0 μmol/L)比較,DHA處理后的實驗組細(xì)胞生存能力受到抑制,A549和H3255細(xì)胞存活率下降,并呈濃度和時間依賴性。A549和H3255的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為52.17 μmol/L和46.06 μmol/L。故后續(xù)實驗均使用50 μmol/L的DHA。見圖1。

圖1 不同濃度的DHA對A549和H3255的生長抑制程度

2.2 DHA抑制A549和H3255細(xì)胞的遷移與侵襲能力Transwell實驗檢測DHA是否對肺癌細(xì)胞株的遷移和侵襲產(chǎn)生影響,用DHA處理A549和H3255細(xì)胞,24 h后觀察遷移實驗的結(jié)果,48 h后觀察侵襲實驗的結(jié)果,觀察并拍照穿過基質(zhì)膠的數(shù)量。24 h后,與對照組比較,DHA組A549和H3255細(xì)胞遷移數(shù)量減少,表明DHA抑制A549和H3255細(xì)胞遷移能力,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(A549:t=-19.190,P<0.001;H3255:t=-24.678,P<0.001),見圖2A、B。48 h后,與對照組比較,DHA組穿過基質(zhì)膠的A549和H3255細(xì)胞侵襲數(shù)量減少,表明DHA抑制A549和H3255細(xì)胞的侵襲能力,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(A549:t=-33.080,P<0.001;H3255:t=-51.824,P<0.001),見圖2C、D。

圖2 DHA抑制A549和H3255細(xì)胞的遷移與侵襲

2.3 DHA影響EMT進程相關(guān)分子mRNA和蛋白表達qRT-PCR檢測EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平。結(jié)果顯示:在A549和H3255細(xì)胞中,DHA組E-cadherin的mRNA表達上升(A549:t=11.445,P<0.001;H3255:t=20.068,P<0.001),N-cadherin的mRNA表達下降(A549:t=-5.847,P=0.004;H3255:t=-5.233,P=0.006),Vimentin的mRNA表達水平同樣也下降(A549:t=-8.333,P=0.001;H3255:t=-13.629,P<0.001),見圖3A。進一步用Western blot技術(shù)驗證E-cadherin,N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平。DHA作用于A549和H3255細(xì)胞24 h后,與對照組比較,DHA組除上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達水平上升(A549:t=24.571,P<0.001;H3255:t=6.062,P=0.004),N-Cadherin(A549:t=-52.589,P<0.001;H3255:t=-50.409,P<0.001)及Vimentin(A549:t=-25.730,P<0.001;H3255:t= -34.694,P<0.001)蛋白表達水平均下降,見圖3B、C。

圖3 DHA影響A549和H3255細(xì)胞EMT相關(guān)分子mRNA和蛋白表達

2.4 DHA抑制VM形成及VE-cadherin表達為了探究DHA對VM的影響,使用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測對照組和DHA組的血管樣結(jié)構(gòu)生成情況。在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h之后,DHA抑制肺癌細(xì)胞血管樣結(jié)構(gòu)生成,即抑制VM的形成,見圖4A。qRT-PCR結(jié)果表明,DHA抑制了VM標(biāo)志物VE-cadherin的mRNA水平表達(A549:t=-10.846,P<0.001;H3255:t=-6.443,P=0.003),見圖4B。Western blot實驗進一步驗證,DHA也抑制了VE-cadherin的蛋白表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(A549:t=-37.691,P<0.001;H3255:t=-11.006,P<0.001),見圖4C。以上結(jié)果表明,DHA抑制VM的形成。

3 討論

肺癌導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡人數(shù)最多。目前,這些病例中超過 85% 被歸類為NSCLC,預(yù)計 5 年生存率僅為 15.9%,在過去的幾十年里,這個數(shù)據(jù)僅略有改善[8]。小分子酪氨酸激酶抑制劑和免疫療法極大的改善了NSCLC患者的生存益處。然而,NSCLC的總體治愈率和生存率仍然很低,特別是在轉(zhuǎn)移性疾病中[9]。因此,尋找一種抑制NSCLC轉(zhuǎn)移和抑制其腫瘤進程的安全高效的藥物顯得尤為重要。青蒿素是一種被廣泛認(rèn)可及應(yīng)用的抗瘧疾藥物,DHA是其第一代衍生物,具有水溶性好,毒性低等特點,其抗癌效應(yīng)在近年來成為熱點。如通過自噬來抑制肝癌細(xì)胞HepG2.2.15的增殖[10],在食管鱗癌中以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點抑制增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[11]等。

轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因,因此,抑制轉(zhuǎn)移是改善臨床結(jié)果中非常重要的一環(huán)。EMT是一種進化上保守的發(fā)育程序,它與致癌作用有關(guān),并通過增強移動性、侵襲性賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性。EMT的復(fù)雜生物學(xué)過程被認(rèn)為是致癌的關(guān)鍵標(biāo)志,而靶向EMT途徑成為了一種有吸引力的癌癥治療策略[12]。EMT的標(biāo)志是失去上皮表面標(biāo)志物,最顯著的是E-cadherin,以及獲得間充質(zhì)標(biāo)志物,包括Vimentin和N-cadherin。在功能上,E-cadherin作為一種腫瘤抑制基因,在調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、分化、遷移和干細(xì)胞樣特性方面發(fā)揮多種作用。在細(xì)胞極性的情況下,E-cadherin與相鄰細(xì)胞結(jié)合,形成細(xì)胞間復(fù)合物,形成上皮屏障。EMT過程中丟失的關(guān)鍵上皮標(biāo)志物包括E-cadherin、Mucin-1、細(xì)胞角蛋白。相反,在此過程中獲得的標(biāo)志物包括N-cadherin、平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白和Vimentin,它們共同構(gòu)成了關(guān)鍵的間充質(zhì)標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果顯示,用DHA處理A549和H3255細(xì)胞后,DHA明顯抑制了NSCLC細(xì)胞的侵襲能力,并且E-cadherin的mRNA和蛋白水平表達增強,N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平受到明顯抑制。因此,本研究證實,DHA可通過抑制EMT,進而抑制A549和H3255細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

VM是最近在許多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的血管生成過程,不同于傳統(tǒng)的涉及血管內(nèi)皮的血管生成過程。腫瘤細(xì)胞沿著現(xiàn)有或新誘導(dǎo)的血管遷移,為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移提供能量。近年來,一些針對血管生成的臨床治療并不令人滿意,這可能是由于VM的激活所致。研究[14]認(rèn)為,EMT和VM息息相關(guān),EMT導(dǎo)致了VM的發(fā)生,在EMT過程中,一些間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物被上調(diào),包括VE-cadherin、纖連蛋白、鈣黏蛋白2和Vimentin。而VE-cadherin 是一個生物標(biāo)志物,在VM的形成過程中起著至關(guān)重要的作用[15]。本研究通過三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察對照組和DHA組VM的形成,發(fā)現(xiàn)DHA抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成,并且DHA組VE-cadherin的mRNA和蛋白表達水平受到明顯抑制,證實了DHA抑制VM,但是否是通過抑制EMT來抑制VM,尚未證實。

綜上所述,本研究于體外證實了DHA抑制NSCLC的A549和H3255細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,誘導(dǎo)E-cadherin mRNA和蛋白表達及抑制N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平表達,抑制EMT效應(yīng);DHA還抑制VM的形成,下調(diào)VE-Cadherin mRNA和蛋白水平表達。但DHA是否通過抑制EMT效應(yīng)進而抑制VM還有待進一步研究。