FTO及其抑制劑對(duì)DLBCL利妥昔單抗耐藥的影響

顧季煒,施 梅,宋國(guó)齊

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是起源于生發(fā)中心的,是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,NHL)中最常見的一種類型[1]。利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松(rituximab,cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,and prednisone,R-CHOP)方案大約能治愈60%的DLBCL患者,其余患者則會(huì)出現(xiàn)難治或復(fù)發(fā)[2]。因此,研究利妥昔單抗獲得性耐藥的機(jī)制具有重大意義。m6A是腺苷N6位發(fā)生甲基化,是一種轉(zhuǎn)錄后修飾,在癌癥發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要的作用[3]。研究[4]表明,MYC基因易位相關(guān)的 DLBCL與 R-CHOP 治療的低生存率相關(guān),這表明MYC可能與DLBCL利妥昔單抗耐藥存在相關(guān)性。脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是一種去甲基化酶[5],在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中R-2-羥基戊二酸(R-2-hydroxyglutarate,R-2HG) 通過靶向FTO/m6A/MYC/CEBPA 信號(hào)傳導(dǎo),抑制了癌細(xì)胞增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。甲氯芬酸鈉(meclofenamic acid,MA)可結(jié)合 FTO 的活性表面,選擇性抑制 FTO 介導(dǎo)的 m6A去甲基化,減少膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的增殖[7]。該研究旨在探討FTO及其抑制劑MA通過MYC、CEBPA影響DLBCL利妥昔單抗的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);健康人血漿(南通大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、CCK-8試劑盒(日本DojinDo公司);AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);利妥昔單抗注射液(上海羅氏制藥有限公司);兔抗人FTO單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司);兔抗人c-Myc單克隆抗體、兔抗人CEBPA單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司);引物由廣州市銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成;Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);酶聯(lián)儀(美國(guó)Biotek公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);蛋白免疫印跡電泳設(shè)備及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);QuantStudio5熒光定量PCR 儀(美國(guó)Thermofisher 公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞來源與培養(yǎng) 選取2種“雙重打擊”淋巴瘤衍生的細(xì)胞系,活化B細(xì)胞樣(ABC型)OCI-LY8(LY8)和生發(fā)中心B細(xì)胞樣(GCB型)OCI-LY18(LY18),均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海保藏中心。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞系,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色及顯微鏡下密度,及時(shí)換液和傳代。

1.2.2耐藥細(xì)胞株模型的建立 采用梯度加藥法誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞系的耐藥,分別將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞系LY8、LY18以0.5×106個(gè)/ml的密度接種于含10%新鮮人血漿的RPMI-1640培養(yǎng)基中,加入0.5 μg/ml利妥昔單抗,12 h后換正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)正常(約4～5 d),在下個(gè)周期將利妥昔單抗?jié)舛忍岣叩角?個(gè)周期的2倍,按此方式重復(fù)9個(gè)周期后,得到對(duì)128 μg/ml利妥昔單抗耐藥的細(xì)胞株(LY8R、LY18R)。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將親本及耐藥細(xì)胞株分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞5×104個(gè),分別加入濃度為0、2、10、50、100 μg/ml利妥昔單抗,每個(gè)平行樣本3個(gè)副孔,孵育48 h后按所提供的實(shí)驗(yàn)步驟在酶聯(lián)儀上測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率。將耐藥細(xì)胞株及經(jīng)MA[根據(jù)藥物說明書MA的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為5.6×10-6mol/L]處理后的耐藥細(xì)胞株分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞5×104個(gè),每個(gè)平行樣本3個(gè)副孔,孵育48 h后,按實(shí)驗(yàn)步驟在酶聯(lián)儀上測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)亡 將親本及耐藥細(xì)胞株均分為2組: 0 μg/ml和50 μg/ml利妥昔單抗組,每組3個(gè)復(fù)孔,于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),48 h后收集細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,PBS洗3次,Binding Buffer重懸細(xì)胞,分別加入FITC-AnnexinV和PI各5 μl,避光孵育20 min。BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率, FlowJo 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5RT-qPCR測(cè)定FTO表達(dá) 收集2×106～3×106個(gè)細(xì)胞,提取總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,采用RT-qPCR檢測(cè)各組FTO的表達(dá)情況,引物序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成,引物序列見表1 。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6Western blot檢測(cè) 收集親本及耐藥細(xì)胞,提取總蛋白,并進(jìn)行BCA蛋白定量分析。SDS-PAGE電泳,隨后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入FTO抗體(1 ∶1 000)、c-Myc抗體(1 ∶1 000)、CEBPA抗體(1 ∶1 000)及GAPDH抗體(1 ∶1 000) 4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,結(jié)束后分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)室溫避光孵育2 h,TBST洗膜5次, ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,Image J測(cè)量條帶灰度值。

1.2.7免疫熒光檢測(cè) 將親本及耐藥細(xì)胞用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,0.5% Triton X-100室溫透化5 min,封閉1 h,PBS洗3次,4 ℃ 過夜孵育熒光一抗FTO,PBS 洗3次、室溫避光孵育熒光二抗2 h,DAPI 染核5 min、滴加抗淬滅液后拍照。

2 結(jié)果

2.1 利妥昔單抗耐藥DLBCL細(xì)胞株鑒定將親本及耐藥細(xì)胞株分別重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基及含10%新鮮人血漿RPMI-1640培養(yǎng)基中,觀察細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示在0、2、10、50、100 μg/ml的利妥昔單抗作用下,LY8及LY8R細(xì)胞的IC50分別為0.54、47.15 μg/ml,耐藥指數(shù)為87.31;LY18及LY18R細(xì)胞的IC50分別為47.90、227.0 μg/ml,耐藥指數(shù)為4.74,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=68.12、7.425,均P<0.001)。見圖1。

圖1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率

2.2 利妥昔單抗處理親本與耐藥細(xì)胞株的凋亡差異與對(duì)照組(0 μg/ml利妥昔單抗組)比較,50 μg/ml利妥昔單抗組和DLBCL耐藥株(LY8R、LY18R)組細(xì)胞凋亡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而親本細(xì)胞株組(LY8、LY18),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)FTO在親本與耐藥 DLBCL 細(xì)胞株中的表達(dá)情況RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,FTO在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)明顯升高,表明FTO可能與DLBCL利妥昔單抗耐藥存在相關(guān)性。見圖3。

2.4 免疫熒光檢測(cè)FTO蛋白在親本與耐藥 DLBCL 細(xì)胞株中的表達(dá)情況免疫熒光結(jié)果顯示,FTO在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)明顯升高,表明FTO可能

與DLBCL利妥昔單抗耐藥存在相關(guān)性。見圖4。

圖4 免疫熒光檢測(cè)FTO蛋白在親本與耐藥DLBCL細(xì)胞株中的表達(dá)情況 ×400

2.5 Western blot檢測(cè) FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在親本與耐藥 DLBCL 細(xì)胞株中的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示FTO、c-Myc在耐藥細(xì)胞株LY8R、LY18R中表達(dá)升高,CEBPA表達(dá)降低,由此可見,FTO可能通過c-Myc、CEBPA影響DLBCL對(duì)利妥昔單抗的耐藥。見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè) FTO、c-Myc及CEBPA在親本及耐藥 DLBCL 細(xì)胞株的表達(dá)

2.6 RT-qPCR檢測(cè)經(jīng)抑制劑MA處理后FTO在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)情況RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)抑制劑MA處理后,FTO在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)明顯降低。見圖6。

圖6 RT-qPCR檢測(cè)經(jīng)抑制MA處理后FTO在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.7 Western blot檢測(cè)經(jīng)抑制劑MA處理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)抑制劑MA處理后FTO、c-Myc在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)明顯減少,而CEBPA在耐藥細(xì)胞株中明顯增多。見圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)經(jīng)MA處理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.8 經(jīng)抑制劑MA處理后耐藥細(xì)胞對(duì)利妥昔單抗耐藥性的影響CCK-8法結(jié)果顯示,經(jīng)MA處理后的LY8R和LY18R在0、2、10、50、100 μg/ml的利妥昔單抗刺激48 h后,細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.37、11.96,均P<0.001),這表明抑制劑MA可能影響了DLBCL對(duì)利妥昔單抗的耐藥性。見圖8。

圖8 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率

3 討論

常規(guī)化療和靶向治療是大部分腫瘤的一線治療方法,大多數(shù)早期腫瘤患者能取得完全或部分緩解,而晚期腫瘤患者往往治療效果不佳,腫瘤細(xì)胞可通過多因素的耐藥機(jī)制逃避化療和靶向治療[8]。腫瘤耐藥的機(jī)制包括藥物代謝改變、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)和靶蛋白/受體改變等,這些都影響藥物與其靶標(biāo)的有效結(jié)合,也是抗癌藥物療效不佳的主要原因[9]。利妥昔單抗作為治療DLBCL的一線藥物,在臨床治療上發(fā)揮重要作用,但耐藥是患者最大的治療障礙,盡管現(xiàn)如今對(duì)利妥昔單抗耐藥機(jī)制尚不清楚,但越來越多的研究表明RNA m6A甲基化修飾促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥,如FTO通過作用于G6PD/PARP1,促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展和化療耐藥,靶向抑制FTO能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并提高化療敏感性[10]。FTO通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)參與乳腺癌對(duì)阿霉素耐藥過程,FTO啟動(dòng)子區(qū)域存在 STAT3 結(jié)合位點(diǎn),能激活乳腺癌細(xì)胞STAT3信號(hào),而STAT3的過度激活與乳腺癌耐藥相關(guān),因此過表達(dá)FTO會(huì)引起乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥[11]。

MYC是研究最廣泛的致癌基因之一,其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、分化、凋亡、DNA 修復(fù)、蛋白質(zhì)翻譯、免疫反應(yīng)和干細(xì)胞形成等過程[12-13]。MYC基因擴(kuò)增與卵巢癌、食管癌、鱗狀肺癌、乳腺癌等預(yù)后不良相關(guān)[14]。MYC染色體重排已被確定為 DLBCL 患者預(yù)后不良因素之一[15],這提示MYC的異常參與了DLBCL耐藥過程。研究[6]發(fā)現(xiàn), R-2HG可通過抑制FTO來促進(jìn)MYC/CEBPA的甲基化水平并促進(jìn)m6A依賴的mRNA降解,從而在AML中發(fā)揮抑癌作用。DLBCL利妥昔單抗耐藥機(jī)制中是否與代謝通路相關(guān),尤其是糖酵解通路等,有待進(jìn)一步研究。

本研究采用梯度加藥法構(gòu)建利妥昔單抗耐藥細(xì)胞系,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Western blot證明去甲基化酶FTO在耐藥株中表達(dá)升高,c-Myc表達(dá)也增高,CEBPA表達(dá)降低,此外,耐藥株經(jīng)MA處理后,FTO表達(dá)下降且c-Myc表達(dá)也降低,CEBPA表達(dá)升高,這提示其可能通過FTO/c-Myc/CEBPA軸發(fā)揮利妥昔單抗抗性作用。CCK-8法結(jié)果顯示,耐藥株經(jīng)MA處理后,細(xì)胞活力降低,表明MA可能影響DLBCL對(duì)利妥昔單抗的敏感性。目前對(duì)于利妥昔單抗耐藥尚無相關(guān)藥物進(jìn)入臨床使用,關(guān)于利妥昔單抗耐藥機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。