MLCK敲除對FaDu細胞凋亡的影響

熊 壘,黃建尚,周 青,汪 淵,左 莉

下咽癌是頭頸部腫瘤中預后最差的鱗狀細胞癌之一[1]。在發達國家并不常見,它主要在吸煙和酗酒的男性中被診斷出來,在女性中很少見;但是在發展中國家,近年來下咽癌的發病率在男性和女性中都有所增加[2]。通常在晚期被發現,且是多灶性的,盡管診斷成像、放射治療、化療和外科手術技術已經得到改善,但5年存活率仍然很低[1]。因此迫切需要找到一個新的治療靶點。肌球蛋白輕鏈激酶( myosin light chain kinase ,MLCK)是一種調節一系列細胞骨架調節蛋白的關鍵酶,已被認為是細胞凋亡的關鍵調節因子[3-4]。該課題組前期研究[1]發現與健康組織比較,MLCK在下咽腫瘤組織中的表達上調,該研究旨在通過CRISPR/Cas 9技術構建MLCK敲除細胞株,并探討其對下咽癌FaDu細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 DMEM高糖培養基和胎牛血清(以色列Biological Industries 公司);Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(PI)(上海貝博生物科技有限公司);胰酶、青-鏈霉素、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司);SteadyPure 通用型基因組DNA提取試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司);LipofectamineTMCRISPRMAXTMCas 9 轉染試劑、Modified sgRNA、Cas9 2NLS Nuclease(美國Synthego公司);2xS6 Universal SYBR qPCR MIX、HyperScriptTM Ⅲ RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover(上海新貝生物科技有限公司);anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-Caspase-3、anti-Cleaved Caspase-3 (美國CST公司);anti-Actin(美國Affinity公司);山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.1.2實驗儀器 LightCycler 96實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)、酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);化學發光凝膠成像分析系統ChemiDoc Touch Imaging System(美國Bio-Rad公司);-80 ℃超低溫冰箱(日本三洋電器股份有限公司);正置生物顯微鏡(德國Leica公司);pH儀(上海雷磁儀器廠);電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1FaDu細胞培養 FaDu細胞購自于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫,傳代至第三代,培養于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,每隔24 h換液,待細胞融合至80%左右時傳代,并取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.2.2FaDu細胞MLCK的敲除 利用Synthego公司提供的在線設計網站,設計出MLCK特異性sgRNA序列UGUGUCCCAAGCUUUCCUUG,sgRNA由達科為生物技術股份有限公司代理購買。

取對數生長期的FaDu細胞按照1×104個細胞/孔接種于24孔板,待細胞長到30%～70%融合度時進行轉染,分為對照組(不加Cas9 2NLS Nuclease 和sgRNA)和實驗組(加0.5 μl Cas9 2NLS Nuclease 和1.5 μl sgRNA),對照組和實驗組中均加入25 μl Opti-MEM培養基和1 μl Liprofectamine Cas 9 Plus Reagent,同時將1.5 μl CRISPRMAXTMReagent加入25 μl的Opti-MEM培養基中,5 min后將兩者混合并輕輕混勻,室溫孵育10 min后加到需要轉染的細胞培養孔中,培養2～3 d后將細胞消化接種于96孔板中,每孔1個細胞。

1.2.3MLCK敲除單克隆細胞株的PCR鑒定 當96孔板內細胞生長到2 000個左右時,用胰酶消化細胞,將其接種于24孔板培養,待細胞生長到80%～90%融合度時,用胰酶消化細胞,留取一半細胞提取DNA進行PCR驗證,另一半細胞繼續擴大培養。提取基因組DNA的方法如下:胰酶消化FaDu細胞后取一半細胞1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入200 μl的PBS懸浮細胞;加入180 μl Buffer BS-2、20 μl的Proteinase K和10 μl RNaseA(10 mg/ml),收集細胞懸液,充分吸打混勻,于56 ℃水浴加熱10 min至溶液完全裂解成澄清透明狀態;向裂解液中加入200 μl無水乙醇,充分吸打混勻;然后將上述溶液轉移至吸附柱中,具體操作參見DNA提取試劑盒說明書。PCR擴增體系為:Premix Taq 25 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,DNA模板1 μl,ddH2O 22 μl。PCR擴增條件為:98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環。將PCR擴增產物通過120 V電壓、1.5%瓊脂糖凝膠進行分離鑒定。將PCR鑒定為陽性的擴增產物送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4RT-qPCR檢測MLCK mRNA表達 收集經測序確定MLCK敲除的2株細胞和對照組細胞,使用ES Science公司的RNA快速提取試劑盒提取總RNA,測定RNA純度和濃度后,用上海新貝生物科技有限公司的反轉錄試劑盒合成cDNA,用安徽醫科大學基礎醫學院公共實驗室羅氏 LightCycler 96 實時熒光定量PCR儀進行擴增,按照試劑盒操作方法檢測各組細胞MLCK mRNA表達水平,采用2-△△Ct法計算MLCK mRNA相對表達量。MLCK引物序列F:5′-ATGTCAGCATAAGGGGAAGGGG-3′,R: 5′- GCTCATTTCACTAAGCATGTTCC-3′;GAPDH引物序列F:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,R: 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 細胞按照5×105個細胞/孔接種在6孔板中,待細胞融合密度達到90%時,胰酶消化收集細胞,以1 000 r/min離心5 min;取沉淀細胞,用冷PBS洗滌細胞2次,用500 μl PBS重懸細胞,滴加2 ml冷乙醇4 ℃固定過夜;取5×106個細胞,在15 ml錐形離心管中2 000 r/min離心10 min,棄上清液,收集細胞;用冷PBS洗滌細胞2次,用500 μl冷PBS重懸細胞,加入RnaseA溶液20 μl,37 ℃水浴30 min;用400目細胞篩網過濾,在2 000 r/min離心10 min,棄上清液,收集細胞;加入400 μl PI染液重懸細胞,輕輕混勻后4 ℃避光孵育1 h,最后用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況,實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞按照5×105個細胞/孔接種在6孔板中,待細胞融合密度達到90%時,用不含EDTA的胰酶消化細胞,用冷PBS洗滌2次,用400 μl 1× Annexin V結合液重新懸浮細胞,在細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育15 min,加入5 μl PI染色液后輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5 min,通過流式細胞儀對MLCK敲除組和對照組的細胞凋亡情況進行檢測并分析細胞凋亡率的變化,實驗重復3次。

1.2.7Western blot實驗 取對數生長期的MLCK敲除和對照組細胞,按照5×105個細胞/孔接種在6孔板中,待細胞融合密度達到90%時,吸棄培養基,用PBS洗3次,每孔加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上充分裂解細胞,14 000 r/min 4 ℃離心20 min。吸取上清液,用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。以4 ∶1的比例加入相應體積的總蛋白和5×蛋白上樣緩沖液,震蕩混勻后在100 ℃水浴中煮沸15 min使蛋白完全變性,冷卻后置于-80 ℃冰箱中保存。電泳時每泳道加入10 μg的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳完成后將蛋白轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加一抗4 ℃孵育過夜,用TBST溶液洗滌3次,每次5 min,室溫孵育二抗2 h,再用TBST洗滌3次后,即可進行曝光,檢測蛋白的表達情況,使用Image J分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 FaDu細胞MLCK敲除的測序結果根據Synthego 公司網站上提供的在線CRISPR Design Tool,選擇靶向MLCK基因第2外顯子上的sgRNA,提取DNA后進行PCR鑒定,并將陽性樣本送測序,測序結果顯示MLCK KO 1細胞株在sgRNA識別序列處缺失了4個堿基(圖1A),MLCK KO 2細胞株則在識別序列發生了堿基的插入與替換(圖1B),表明成功構建了MLCK KO 1和MLCK KO 2細胞株。

2.2 敲除MLCK對FaDu細胞MLCK mRNA和蛋白表達的影響收集培養的FaDu細胞株,RT-qPCR方法檢測細胞中MLCK mRNA的表達。結果顯示,MLCK敲除細胞株中mRNA表達量降低(F=903.8,P<0.000 1,圖2A)。Western blot方法鑒定細胞中MLCK蛋白表達,MLCK敲除組中蛋白水平降低(F=2742,P<0.000 1,圖2B)。

2.3 敲除MLCK對FaDu細胞周期的影響在FaDu細胞中敲除MLCK,通過流式細胞技術檢測細胞周期。結果顯示,與對照組比較,MLCK敲除組細胞周期各時期變化并不明顯,這說明敲除MLCK不影響細胞的增殖(圖3)。

圖3 MLCK敲除對FaDu細胞周期的影響

2.4 敲除MLCK對FaDu細胞凋亡的影響在FaDu細胞中敲除MLCK,通過流式細胞術檢測細胞凋亡。結果顯示,與對照組比較,MLCK敲除組凋亡增加,這說明敲除MLCK會誘發細胞凋亡(F=93.52,P<0.000 1,圖4 )。

圖4 敲除MLCK 對FaDu細胞增殖的影響

2.5 敲除MLCK對FaDu細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3表達的影響Western blot 方法檢測細胞中凋亡相關蛋白表達。結果顯示,MLCK敲除組Bax和Bcl-2的比值(F=99.40,P<0.000 1)以及Cleaved Caspase-3與Caspase-3的比值(F=31.17,P=0.000 7)均增加,說明MLCK敲除誘發細胞凋亡(圖5)。

圖5 敲除MLCK對FaDu細胞中凋亡相關蛋白的影響

3 討論

下咽癌相對罕見,約占所有頭頸部惡性腫瘤的3%,惡性程度高,為頭頸部預后最差的惡性腫瘤之一[5]。早期無特征性臨床表現,一般下咽癌患者總是在中晚期才被診斷出來,預后較差。因此,有必要尋找新的標志物,為患者提供早期發現和治療。本課題組前期研究[1]發現MLCK在人下咽癌組織中的表達高于正常的鄰近組織,且與5年生存率有關,MLCK高表達患者的生存率較低,提示MLCK可能是潛在治療腫瘤的有效靶點。MLCK蛋白由MYLK基因編碼,MYLK基因是一個單拷貝基因,含有2個啟動子,分別轉錄長MLCK和短MLCK,短MLCK又稱平滑肌MLCK[6]。研究[7]報道,MLCK是免疫介導的屏障喪失的主要調節因子,MLCK特異性抑制劑可緩解TNF和抗CD3抗體誘導的屏障喪失,而MLCK敲除可保護TNF和抗CD3誘導的結腸炎的發生。研究[8-9]表明,潰瘍性結腸炎和克羅恩病中MLCK的表達明顯增加。免疫活化誘導的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的研究[10]顯示MLCK在GVHD患者組織中明顯升高,而MLCK敲除限制GVHD的進展。此外,同型半胱氨酸可增加Caco 2細胞中MLCK蛋白的表達,從而引起跨上皮電阻的降低,增加上皮細胞通透性[11]。MLCK除了在維持上皮細胞屏障通透性平衡中具有重要作用外,另外一些研究[3-4,12]顯示MLCK影響細胞的增殖和凋亡。研究[13]表明,在肝癌細胞中,過表達MLCK減少細胞凋亡,而抑制MLCK增加細胞凋亡。

細胞凋亡的主要途徑有死亡受體途徑和以線粒體凋亡途徑,線粒體信號通路在調節細胞凋亡中起著重要作用。線粒體凋亡途徑上Bcl-2蛋白家族作為參與細胞凋亡的核心家族,對凋亡的意義尤為重要[14]。

目前尚無報道對下咽癌MLCK敲除引起細胞凋亡的研究,本課題組為了進一步探索MLCK在下咽癌發生發展中的作用,首先利用CRISPR/Cas 9技術敲除MCLK,構建MLCK敲除的FaDu細胞株。通過測序發現MLCK敲除細胞株堿基序列發生缺失或替換,并通過RT-qPCR和Western blot檢測敲除效率,發現MLCK敲除組mRNA和蛋白水平低于對照組,說明MLCK敲除株構建成功。通過流式細胞術發現,MLCK敲除并不影響細胞增殖,但誘導細胞凋亡,這決定了MLCK在下咽癌中起癌基因的作用。此外,敲除MLCK,Western blot結果顯示凋亡相關蛋白:Bax、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3表達增加,然而,本研究中課題組發現一個現象,即MLCK敲除組中Bcl-2的表達水平與對照組相比增高,而不是降低。造成這種現象的原因可能為MLCK敲除引起細胞啟動自身的應急保護機制,調用自身抗凋亡系統來抵抗損傷,但是Bax與Bcl-2的比值MLCK敲除組與對照組相比增高,說明MLCK敲除組細胞發生凋亡,結合Cleaved Caspase-3/Caspase-3增高,進一步說明敲除MLCK誘導下咽癌細胞的凋亡,但具體機制需進一步研究。

綜上所述,本研究構建了MLCK敲除的2株細胞,通過流式細胞術和Western blot實驗證明MLCK敲除誘導細胞凋亡,為進一步開展MLCK在下咽癌的功能和作用機制奠定了重要基礎。