基于熒光法及分子對接研究黃褐毛忍冬抑制丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性

楊 欣,肖俊偉,唐婷婷,危 英,陳 英,向良珊,周 英

丙型肝炎是因為感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的慢性疾病,易發展為慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌,其傳播主要與輸血有關。HCV由于病毒株高度變異性導致疫苗的開發變得非常困難,目前尚無針對 HCV的疫苗[1-2]。人類使用植物藥治療疾病已有上千年的歷史,一些天然產物顯示出抗病毒的活性,如抗皰疹病毒、流感病毒、獲得性免疫缺陷綜合征、乙型肝炎病毒和HCV等[3-4]。黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng)為忍冬科、忍冬屬藤本植物,具有清熱解毒,疏散風熱的功效,主治溫病發熱、熱毒血痢、癰腫疔瘡等多種感染性疾病[5],分布廣泛,資源豐富,且產量高。2020版《中國藥典》將其收載為山銀花基源植物之一[6],該藥材在民間常用于代茶飲,其水煎劑或醇提物已制成藥,如雙黃連注射液、銀黃注射液等已作為抗病毒藥物廣泛應用于臨床。該研究采用熒光法和分子對接技術檢測黔產道地藥材黃褐毛忍冬抗HCV NS3/4A 蛋白酶活性,擬期從中藥、民族藥中發現更多的抗病毒藥效物質,阻斷HCV的復制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗藥材來源 黃褐毛忍冬藥材于2016年3月采自貴州興義,由貴州中醫藥大學陳德媛教授鑒定為LonicerafulvotomentosaHsuetS.C.Cheng,植物標本存放在貴州中醫藥大學科研樓中藥民族藥活性篩選實驗室(標本號為LF201607)。

1.1.2實驗試劑 HCV NS3/4A蛋白酶 、HCV 蛋白酶試劑盒購自美國AnaSpec公司;信筒子醌購自美國Sigma Aldrich 公司;綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰氈毛忍冬苷乙購自成都德銳可生物有限公司,樣品純度≥98% 。

1.1.3實驗儀器 Synergy Ⅱ酶標儀購自美國Bio Tech 公司 ,分析天平MS205DU購自瑞士Mettler Toledo公司,384孔板購自美國Corning公司,Mili-Q系統超純水購自美國Millipore 公司,DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1黃褐毛忍冬不同提取物及主要活性成分 取黃褐毛忍冬藥材25 g,共4份,粉碎,分別加250 ml的蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇,超聲2 min后,加熱回流提取3次,第1、2次回流提取1 h,第3次回流提取30 min,合并提取液,減壓濃縮成浸膏,真空干燥,采用 UPLC-HRMS 技術對黃褐毛忍冬水提物及不同醇提物的化學成分變化情況進行研究[7]。結合對照品比對、液質提供的精確分子量和多級質譜碎片離子信息進行定性分析,根據 Lipinski 類藥五原則進行篩選。

1.2.3受體與配體文件準備 從蛋白質晶體結構數據庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取HCV蛋白酶(PDB ID:1NS3)。利用 SYBYL2.1.1 對蛋白晶體結構進行抽離配體、刪除水分子、加氫、修復側鏈氨基酸、加電荷、提取配體等前處理,保存備用;運用 SYBYL2.1.1 構建黃褐毛忍冬主要活性成分配體庫并完成分子優化,設置參數:選擇 GasteigerHückel 電荷,采用 Tripos 力場,最大迭代系數設置為 10 000,其它參數均設為默認值。

1.2.4SYBYL 2.1.1分子對接實驗 基于 SYBYL2.1.1 的 Docking Suite 模塊,讀取已生成的受體 SFXC 格式文件開始對接工作[9]。實驗結果以總分>5為閾值,采用Ligplot1.4.5軟件進行相互作用分析。實驗結果以氫鍵、疏水作用和結構比對輸出,篩選關鍵的氨基酸位點。

1.2.5實驗驗證分析 采用熒光法驗證6個黃褐毛忍冬中主要成分(綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰氈毛忍冬苷乙和常春藤皂苷元)抑制HCV NS3/4A蛋白酶的活性[10-13]。使用SensoLyteTM 520熒光HCV NS3/4A 蛋白酶試劑盒,操作方法與前面實驗保持一致性。

2 結果

2.1 黃褐毛忍冬不同溶劑提取物體外抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性在濃度為1.0、0.1和0.01 mg/ml時,黃褐毛忍冬不同溶劑提取物對HCV NS3/4A蛋白酶具有不同程度的抑制作用(表1),IC50值范圍為0.005～0.019 mg/ml,其中黃褐毛忍冬60%醇提物顯示較強的抗HCV NS3/4A蛋白酶的活性。

表1 黃褐毛忍冬不同溶劑提取物體外抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性

2.2 配體優化綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、木犀草素、灰氈毛忍冬苷乙、常春藤皂苷元6個活性成分可遵循Lipinski 類藥五原則。基于SBYBL對黃褐毛忍冬活性成分進行優化,圖1A為未優化的活性成分棒狀模型(Sticks),共有6個配體,紅色代表氫原子,藍色代表氧原子。對小分子配體進行基于Tripos力場的能量最小化計算,優化分子結構,獲得合理構象(圖1B)。

圖1 黃褐毛忍冬主要活性成分優化

2.3 受體優化基于PDB數據庫下載HCV蛋白酶結構見圖2A,Resolution:2.80 ?,通過SYBYL去水、加全氫、加電子,選擇Ligand(B/ZN690)模式形成口袋。圖2B綠色區域為對接口袋的位置,是受體中配體結合的區域。

圖2 HCVNS3/4A蛋白酶優化及結合口袋

2.4 分子對接分析基于原配體進行對接,陽性對照信筒子醌與HCV蛋白酶的 總分為 7.1,C分數值為 5,說明信筒子醌與HCV 蛋白酶結合能力較好。綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、木犀草素與HCV蛋白酶有較好的結合(總分>5),其中異綠原酸A、木犀草素與HCV蛋白酶結合能力接近陽性對照藥(表2),課題組將采用實驗研究驗證分子對接的結果。

表2 黃褐毛忍冬主要活性成分與HCV蛋白酶分子對接

2.5 相互作用分析運用 Ligplot1.4.5軟件對結合較好的蛋白復合物相互作用力進行分析,明確氫鍵和疏水作用力在對接中起著重要的作用。綠原酸與HCV結合后形成4個氫鍵(Ser139、 His57、 Lys136、Arg109);異綠原酸A與HCV結合后形成7個氫鍵(Gly137、Lys136、Cys159、His57、Ser42、Arg156、Thr40);木犀草苷與HCV結合后形成2個氫鍵(Lys136、Gln41);木犀草素與HCV結合后形成1個氫鍵(Gln41);信筒子醌 與HCV結合后形成3個氫鍵(Ser42、Lys136、Thr40)。

2.6 熒光法測試黃褐毛忍冬主要化合物抗HCV NS3/4A 蛋白酶活性在濃度為0.01 mg/ml時, 結果顯示均具有抑制HCV蛋白酶活性(表3),其中異綠原酸A和木犀草素對HCV NS3/4A蛋白酶抑制率分別為60.5%和43.1%。異綠原酸A、木犀草素的IC50值分別為0.008 mg/ml和0.019 mg/ml。

表3 黃褐毛忍冬主要活性成分抑制HCV NS3/4A 蛋白酶活性(n=3)

3 討論

HCV是引發肝臟疾病的主要病因,對人類健康影響較大,尚無疫苗預防 HCV 感染,近 10 年來治療主要以利巴韋林聯合長效聚乙二醇 I 型干擾素,但是存在聯合抗病毒治療無效的情況,同時也容易出現副作用,如抑郁癥、機體免疫下降、貧血等,且聯合用藥周期長,因此在臨床上應用受限。HCV復制的兩個主要藥物病毒因子包括RNA聚合酶NS5B和非結構蛋白NS3/4A[14]。目前已經成為人們篩選藥物的關鍵靶點,且取得了較大的進展,但臨床治療藥物治療費用較高,不能讓所有患者受益。因此不斷從中藥中開發低毒、高效、安全的抗病毒小分子用于HCV的治療具有現實意義。黃褐毛忍冬60%醇提物具有較強的抗HCV 蛋白酶活性,其有效部位單獨或與其他藥物復配,可用于研制治療丙型肝炎藥物的原料藥[15]。分子對接和實驗結果發現其主要成分木犀草素和異綠原酸A顯示較好的抗HCV的作用,為從中藥和民族藥中開發丙型肝炎非肽類藥物提供依據。