血清外泌體miR-30d-5p靶向RHOB在三氯乙烯藥疹樣皮炎中的作用

蔡曙陽,王 慧,張雪松,左緒磊,馬金茹,洪依婷,吳奇峰,朱啟星,

三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一種工業(yè)上常用的有機溶劑,在TCE接觸的職業(yè)工人中,少部分可出現類似于藥疹樣皮炎的皮膚大面積表皮壞死和剝脫,臨床上稱為三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,OMDT)[1]。除了皮膚損傷外,部分OMDT患者還伴有嚴重的肝功能異常,因此,開展TCE引起的肝臟損傷及其機制研究,具有重大的職業(yè)衛(wèi)生意義。

目前,OMDT通常被認為是一種由T淋巴細胞介導的Ⅳ型變態(tài)反應為主的復合免疫反應[2],早些研究發(fā)現多種免疫細胞可以分泌外泌體,如巨噬細胞[3]、樹突狀細胞[4]和NK細胞[5],這些外泌體廣泛存在于血液、尿液和唾液等體液中[6],參與免疫細胞間的通信作用。外泌體中miR-30d-5p被發(fā)現參與多種免疫反應,如非分型流感嗜血桿菌引起的急性中耳炎[7]、布氏弧桿菌引起的胃腸炎[8]等 ,但是在TCE引起的免疫性肝臟損傷中miR-30d-5p是否發(fā)揮作用還尚不明確。因此,該研究旨在探索OMDT患者肝臟損傷機制中miR-30d-5p的作用及可能參與的生物信息學過程。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2020年廣東省職業(yè)病防治院收治的OMDT患者6例,所有病例均按照 GBZ 185—2006《職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標準》進行診斷[9]。納入標準:① 有明確的TCE接觸史;② 出現以皮疹、發(fā)熱、肝功能損害和淺表淋巴結腫大等臨床表現;③ 既往身體健康,無藥物、食物過敏史。排除標準:① 有激素用藥史或肝毒性藥物使用史;② 有肝病家族史;③ 發(fā)病前接觸其他明確的職業(yè)危害因素。另在安徽醫(yī)科大學校醫(yī)院收集肝功能正常的健康志愿者6例,與患者按照年齡(±3歲)和性別1 ∶1匹配?；颊吒喂δ苤笜私Y果由住院病歷中的檢測報告單獲得。本研究經安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究倫理委員會審核批準(批準號:5101302),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑血清外泌體提取試劑盒、miRNA提取試劑盒(德國Qiagen公司);miRNA反轉錄試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];Mix溶液(瑞士Roche公司);HSP-70抗體、Flotillin-1抗體、CD9抗體(英國Abcam公司);RIPA裂解緩沖液、PMSF蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術有限公司);PVDF膜、Western blot發(fā)光液試劑盒(德國GE Healthcare公司);miR-30d-5p mimics、miR-NC mimics、野生和突變RHOB質粒、轉染試劑(上海吉瑪制藥技術有限公司);HEK-293T細胞由安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院贈予;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素(美國Gibico公司)。聚合酶鏈式反應PCR儀(瑞士Roche公司,Light Cycler 96);納米顆粒跟蹤分析儀(德國Particle Metrix公司,PMX-120);透射電子顯微鏡(美國Thermo Scientific公司,Ta1os L120C G2);Western blot全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司,Chemiscope 6000 Touch);微孔板發(fā)光檢測儀 (美國Promega公司,GloMax96)。

1.3 血清收集與外泌體提取用含有促凝劑的采血管收集新鮮全血,室溫靜置5 min后以3 000 r/min離心15 min,將上層血清分裝置于-80 ℃冰箱保存。取2 ml血清樣本,按照血清外泌體提取試劑盒說明書進行操作,首先將溶解后的血清用0.22 μm過濾器過濾,與緩沖液XBP等體積混合,2 000 r/min離心1 min,之后加入3.5 ml的緩沖液XWP,12 000 r/min離心5 min,最后加入400 μl的緩沖液XE,2 000 r/min離心5 min,用PBS溶液重懸收集外泌體。

1.4 外泌體鑒定

1.4.1透射電子顯微鏡觀察 將收集的外泌體用200 μl的PBS溶液重懸后滴至潔凈封口膜上,然后用鑷子夾取一枚載網置于外泌體液滴上,懸浮10 min,用濾紙緩慢吸干;后轉移載網到2.5%戊二醛液滴上,懸浮5 min,用濾紙吸干;最后將載網轉移到去離子水液滴上漂洗10次,每次2 min,漂洗完畢后用濾紙吸干,轉移載網到40 g/L乙酸雙氧鈾液滴上染色10 min,濾紙吸干后轉移載網到10 g/L甲基纖維素液滴上染色5 min,濾紙吸干液體后室溫靜置干燥10 min,放入樣品架電鏡下觀察記錄。

1.4.2納米顆粒跟蹤分析 首先用去離子水清洗機器樣本池,然后以聚苯乙烯微球(100 nm)標準品對機器進行校準,再使用1×PBS溶液清洗機器樣本池。準備工作完成后將外泌體樣本用PBS溶液稀釋至1×106/ml,用注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀,每個樣本重復測量3次,軟件會對樣本里顆粒的運動特征進行記錄,同時加以分析后會得到粒徑-濃度分布圖數據,可以檢測外泌體樣品的粒徑大小。

1.4.3Western blot法檢測外泌體標志蛋白 提取外泌體樣品蛋白并定量,然后使用SDS-PAGE進行電泳分離,200 mA轉膜3 h,將PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。之后將膜與HSP-70(1 ∶1 000)、Flotillin-1(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)抗體一起置于4 ℃孵育過夜。第2天,將膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗滌3次,每次10 min,然后與山羊抗兔IgG抗體或山羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)一起室溫孵育2 h。將膜在含有0.05% Tween-20的TBST中洗滌3次,每次10 min,用ECL檢測試劑盒進行顯影。

試驗數據采用SAS 9.0軟件的統(tǒng)計程序進行T檢驗分析，統(tǒng)計結果P＜0.01表示組間差異極顯著，P＜0.05表示組間差異顯著，0.05≤P＜0.10表示組間差異趨于顯著。

1.5 外泌體RNA提取與qRT-PCR檢測使用外泌體RNA純化試劑盒提取血清外泌體中包含miRNA的總RNA,采用加尾法逆轉錄為cDNA。于PCR儀中進行擴增,擴增條件:95 ℃預變性5 min后以95 ℃ 15 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)45次。所得結果使用比較循環(huán)閾值(2-ΔΔCt)法分析,以miR-16作為內參基因,計算miR-30d-5p的相對表達量,每個樣本重復檢測3次。引物序列:miR-16(F):GC-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG;miR-30d-5p(F):TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG;通用引物(R):CGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

1.6 細胞培養(yǎng)與雙熒光素酶報告基因實驗驗證將HEK-293T細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。使用購買的RHOB質粒與miR-30d-5p(miR-NC)模擬物進行實驗。取對數生長期的HEK-293T細胞以2×105個/孔的密度接種于6孔板上,根據說明書進行操作,分別將配套的轉染試劑與miR-NC模擬物、miR-30d-5p模擬物、野生型RHOB質粒、突變型RHOB質粒等共同加入細胞,隨機分為4組:野生型+miR-30d-5p組(共轉染野生型質粒和miR-30d-5p模擬物)、野生型+miR-NC組(共轉染野生型質粒和miR-NC模擬物)、突變型+miR-30d-5p組(共轉染突變型質粒和miR-30d-5p模擬物)、突變型+miR-NC組(共轉染突變型質粒和miR-NC模擬物),6 h后棄去換成新的培養(yǎng)基,再過12 h左右完成轉染過程,此時檢測各組中螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.7 生物信息學分析采用功能聚類(gene ontology,GO)數據庫對基因產物的屬性進行分析,它包含三大類:生物學過程(biological process,BP);細胞組分(cellular component,CC);分子功能(molecular function,MF)。在Gene Ontology中輸入miR-30d-5p,并選擇物種為人類,檢索后得到富集結果。途徑富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是分析基因功能、聯系基因組信息和功能信息的數據庫。在本研究中,使用KEGG數據庫中的代謝通路數據庫進行檢索分析,探索miR-30d-5p的靶基因可能與哪些通路相關。

2 結果

2.1 研究對象基本情況12例研究對象均無激素用藥史或肝毒性藥物使用史,無肝病家族史,6例OMDT患者中男性4例(66.7%),女性2例(33.3%),均有明確的TCE接觸史,與6例健康志愿者按性別和年齡與患者1 ∶1進行配對。以M(P25,P75)計,可知:OMDT患者年齡為20.0(17.5～23.8)歲;健康志愿者年齡為23(19.8～24.5)歲,經秩和檢驗兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.194,P>0.05)。

2.2 血清外泌體的鑒定電鏡觀察外泌體呈圓形、橢圓形,具有雙層脂質包膜結構,Western blot法檢測發(fā)現外泌體特征性膜蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表達陽性,納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體粒徑約200 nm,均符合外泌體的特征,見圖1。

圖1 血清外泌體鑒定

2.3 血清外泌體中miR-30d-5p基因表達水平的改變qRT-PCR結果顯示,對照組、發(fā)病高峰期組和發(fā)病恢復期組血清外泌體中miR-30d-5p相對表達水平分別為:0.90(0.58,2.12),0.14(0.01,0.55),0.93(0.73,1.29)。發(fā)病高峰期組血清外泌體中miR-30d-5p表達水平明顯低于其他兩組,差異有統(tǒng)計學意義(H=6.398,P=0.034),見圖2。

圖2 患者各組血清外泌體miR-30d-5p表達水平

2.4 OMDT患者治療前后肝功能指標水平的改變肝功能檢查結果顯示,6例患者入院時發(fā)病高峰期天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase,AST) 、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT) 、γ-谷氨酰胺基轉移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)明顯升高,與出院時發(fā)病恢復期比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028;Z=-2.201,P=0.028),見圖3。

圖3 OMDT患者肝功能指標水平

表1 OMDT患者血清外泌體miR-30d-5p表達水平與肝功能指標的相關性分析

2.6 OMDT患者血清miR-30d-5p表達水平的生物信息學分析在miRWalk數據庫中篩選出了535個miR-30d-5p的候選靶基因,在miRBD數據庫中篩選出了736個miR-30d-5p的候選靶基因,兩個數據庫的交集顯示了46個候選靶基因,采用GO分析和KEGG分析對這些候選靶基因結果進行進一步研究。GO分析從生物學過程、細胞組分和分子功能三個方面對結果進行描述,發(fā)現miR-30d-5p主要參與鈣調素結合與鈣調蛋白依賴性蛋白激酶的激活等73個分子功能,異三聚體G蛋白與轉運囊泡膜等81個細胞組分以及血管形態(tài)學重構與肽基絲氨酸磷酸化等172個生物學過程,圖4中展示的是相關性較為密切的前10個結果。KEGG分析表明大多數候選靶基因在膽堿能突觸、破骨細胞分化、Apelin信號通路、Wnt信號通路和Oxytocin信號通路等途徑中富集,圖4中展示的是相關性較為密切顯著的前30個條目。上述結果說明miR-30d-5p廣泛參與機體免疫反應的生理病理學過程。

圖4 功能聚類分析和生物通路分析

2.7 miR-30d-5p靶向調控RHOB基因為進一步明確miR-30-5p發(fā)揮生物學功能的可能機制,在上述生信分析結果中選取RHOB基因進行下一步研究。利用psiCHECK2質粒作為骨架,將預測的miR-30d-5p與RHOB結合部位序列及其突變體序列剪切并插入到螢火蟲熒光素酶基因下游,分別構建野生和突變的RHOB表達載體,與miR-30d-5p模擬物或miR-NC模擬物同時轉染入293T細胞進行雙熒光素酶活性檢測實驗。結果顯示:轉染miR-30d-5p模擬物可顯著下調帶有RHOB野生3′-UTR序列的報告基因熒光素酶活性,而靶基因序列突變后的熒光素酶活性不受影響,轉染miR-NC模擬物后不影響野生和突變組的報告基因熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學意義(F=11.458,P=0.003),見圖5。以上結果證明miR-30d-5p模擬物可特異性靶向結合RHOB的3′-UTR序列,從而調控RHOB的表達水平。預測結合位點序列:RHOB 3′UTR:...AUGGUGAGCUUAUGAUGUUUACA...;miR-30d-5p 3′UTR:GAAGGUCAGCCCCUACAAAUGU。

圖5 雙熒光素酶報告基因

3 討論

職業(yè)人群暴露TCE主要通過呼吸道和皮膚進入機體發(fā)揮毒性作用,影響多種臟器,其中以肝臟最為多見,可繼發(fā)肝炎等多種疾病,嚴重影響患者預后。本研究6例患者在發(fā)病高峰期肝功能指標異常升高,存在明顯的肝臟損傷。目前OMDT的肝損傷發(fā)病機制并未完全闡明,有待進一步研究。

一項研究[10]顯示TCE暴露工人的外周血血清miR-150-5p等miRNA分子表達水平有明顯改變,另一項研究[11]顯示血清外泌體miR-21-5p和miR-339-5p表達水平與職業(yè)性三氯乙烯超敏反應綜合征相關,外泌體miR-21和miR-690也被發(fā)現加重了TCE介導的免疫炎癥反應[12]。因此,血清外泌體包裹的miRNA作為一種穩(wěn)定的功能分子,無論是作為臨床治療的靶點,還是作為早期預測或診斷的生物標志物,在OMDT的臨床研究中都具有廣闊的前景。先前的研究[13]表明,miR-30d-5p可以通過參與T細胞與B細胞的激活調控機體的免疫反應,并且與非酒精性脂肪性肝等多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關,結合一項關于TCE暴露人群miRNA的芯片研究[14],其中miR-30家族有明顯差異表達,因此本研究選擇了miR-30d-5p進行深入探討。

本研究收集了OMDT患者的血清后提取外泌體,并對其進行鑒定。目前普遍認為外泌體的直徑在30～150 nm之間,微囊泡的直徑一般在100～1 000 nm之間,本研究結果中顯示其直徑約為200 nm,屬于粒徑偏小的一部分,參考相關文獻后依然選擇外泌體對其進行描述[15]。電鏡結果顯示其呈圓形、橢圓形,具有雙層脂質包膜結構,Western blot結果顯示其表面的特殊蛋白CD9、Flotollin-1和HSP70表達呈陽性,與文獻報道的結果一致[16],為后續(xù)研究奠定了基礎。qRT-PCR結果顯示,OMDT患者發(fā)病高峰期時血清外泌體的miR-30d-5p水平明顯降低,并且與AST、ALT和GGT指標呈現負相關,推測血清外泌體miR-30d-5p可能參與了OMDT患者的肝臟損傷的過程。

對miR-30d-5p進行靶基因的預測及生物學信息分析結果顯示,miRWalk及miRBD數據庫共預測到46個miR-30d-5p的可能靶點,其中RHOB是一種小的GTP酶,屬于GTPase信號分子家族,是細胞分裂、膜泡運輸、傷口愈合或免疫監(jiān)視等多種細胞和生理過程中的關鍵介質,同時還被發(fā)現參與非酒精性脂肪肝病、肝纖維化等多種肝臟損傷[17],這與GO分析結果高度相似。KEGG結果顯示了RHOB可能參與的信號通路,其中包括cAMP、Wnt、calcium在內的大多數都與免疫性肝病密切相關。miR-30d-5p與RHOB的靶向關系在多個網站被預測到(http://www.targetscan.org、http://genome.ucsc.edu),雙熒光素酶報告基因結果顯示,miR-30d-5p模擬物可特異性靶向結合RHOB的3′-UTR序列,說明miR-30d-5p可以負向調控RHOB的表達,本研究雖然未能檢測OMDT患者肝臟的RHOB表達水平,但是在課題組正在進行的TCE致敏小鼠模型研究基礎上發(fā)現致敏陽性鼠的肝臟組織中RHOB基因表達水平明顯升高,提示RHOB有望成為OMDT的治療靶點之一。

綜上所述,OMDT患者血清外泌體miR-30d-5p表達水平降低,與肝臟損傷程度呈負相關,并且本研究確定了miR-30d-5p與RHOB基因的靶向調控關系,為深入研究OMDT患者肝損傷的具體調控機制提供了指導方向,但本研究實驗中并未對miR-30d-5p的表達進行干預,因此還需要進一步研究以獲得確定性的結論。