不同日齡湖羊羔羊瘤胃上皮細菌的差異

紀雯雯，云 燕，王 翀，茅慧玲

（浙江農(nóng)林大學 動物科技學院/動物醫(yī)學院，浙江 杭州 311300）

斷奶是反芻動物飼養(yǎng)過程中必須經(jīng)歷的一個階段，而早期斷奶是為提高生產(chǎn)效率所采用的技術手段之一。斷奶前瘤胃的充分發(fā)育為斷奶成功實施和緩解斷奶應激有著重要的意義[1]。近年來，瘤胃上皮細菌的變化受到研究學者的關注。有研究認為：不同于瘤胃內(nèi)容物相關的細菌群落[2]，瘤胃上皮細菌群落在幼齡反芻動物中具有某些特定的功能(宿主代謝、免疫應答和瘤胃發(fā)育)[3-4]。瘤胃內(nèi)容物相關細菌受到諸多宿主因素影響，如日糧、年齡、抗生素攝入以及宿主的健康；此外，這些菌群也受到環(huán)境因素的影響，如地理位置、季節(jié)和飼養(yǎng)方式等[5]。然而上述因素對瘤胃上皮相關菌群影響還未見報道。因此，準確認識瘤胃上皮細菌在反芻動物生長過程中的演化，有利于進一步通過營養(yǎng)手段調(diào)控瘤胃上皮細菌的組成，促進瘤胃上皮細菌的盡早成熟，為調(diào)控幼齡反芻動物的發(fā)育提供新思路。鑒于此，本研究以湖羊Ovisaries羔羊為研究對象，探討了2 個日齡羔羊瘤胃上皮細菌群落結構以及多樣性的差異，為幼齡反芻動物實施早期斷奶技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用10 只出生體質(zhì)量相近[(3.60±0.37) kg]的初生湖羊羔羊，于日齡5 d 時飼喂代乳粉，每天3 次，自由采食；并于日齡10 d 開始飼喂開食料及羊草。代乳粉、開食料和羊草的營養(yǎng)水平見表1。羔羊分別于日齡30 d (D30)和45 d (D45)屠宰5 只(n=5)。屠宰后，立即將瘤胃組織用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)沖洗3 次，以清除不能附著的細菌，先置于液氮中，后迅速轉移至-80 ℃保存。

表1 飼料的化學成分組成Table 1 Chemical composition of the feeds

1.2 瘤胃上皮菌群16S rDNA 基因的高通量測序

羔羊瘤胃上皮樣品送至上海銳翌生物科技有限公司進行測序及微生物多樣性分析。提取羔羊瘤胃上皮細菌總DNA 后，用341F/806R 通用引物(上游為5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′；下游為5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)擴增16S rDNA保守區(qū)域V3～V4 區(qū)，并對產(chǎn)物進行純化，定量和均一化形成測序文庫，測序平臺為Illumina HiSeq PE250。測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進行全質(zhì)控，通過97% 相似度的標準聚類，得到操作分類單元(OTU)，每個OTU 被認為可代表1個物種。將具有代表性的OTU 序列與數(shù)據(jù)庫比對，得到每個OTU 對應的物種分類信息以及從門到屬水平各樣品的群落組成情況[6]。原始數(shù)據(jù)提交到美國生物技術信息中心(NCBI)，序列號為PRJNA857329。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行整理，結果采用SAS 8.0 軟件Duncan’s 方差分析對各處理組進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 微生物α 多樣性

下機序列經(jīng)拼接、優(yōu)化、質(zhì)控后共得到460 073 條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個樣品為(57 509±7 989)條。共獲得OTU 為503 個，平均每個樣品OTU 有(252±38)個。2 組瘤胃上皮細菌的稀疏曲線見圖1，雖然沒有得到完全的平緩，但斜率在不斷的減小，說明趨向于飽和。

圖1 樣品稀疏曲線Figure 1 Rarefaction curves of samples

從α 多樣性指數(shù)(表2) 可知：D45 組羔羊瘤胃上皮細菌的OTU 個數(shù)顯著多于D30 組羔羊(P＜0.05)，Chao1 指數(shù)D45 組有增加的趨勢(P=0.07)，但是Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)2 組間均差異不顯著(P＞0.05)，Coverage 指數(shù)2 組均在99%以上。因此，說明測序深度能準確反映湖羊瘤胃上皮微生物組成。

表2 不同日齡羔羊瘤胃上皮細菌多樣性指數(shù)Table 2 Ruminal epithelial bacterial diversity of Hu lambs at different ages

從韋恩圖(圖2)可見：不同日齡湖羊羔羊瘤胃細菌共有的OTU 數(shù)為271 個，D45 組羔羊特有的OTU 為169 個，而D30 組羔羊特有的OTU 數(shù)較少，為63 個。

圖2 不同日齡湖羊羔羊瘤胃細菌OTU 韋恩圖Figure 2 Venn diagram showing the unique and shared OTUs at different ages in bacterial communities of Hu lambs

基于UniFrac 的加權主坐標分析其第1 主成分和第2 主成分的貢獻率分別為44.50%和19.51%(圖3)。兩組羔羊個體差異較為顯著，分布較為渙散，然而D30 組和D45 組分離較遠，說明隨著日齡的增長羔羊瘤胃上皮細菌分布存在差異。

圖3 基于OTU 水平的主坐標分析Figure 3 PCoA based on OTU level

2.2 物種分類

2.2.1 門水平 瘤胃上皮細菌門分類圖(圖4)顯示：瘤胃上皮細菌主要歸于厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria 和放線菌門Actinobacteria 四大類。D45 組(14.10%)放線菌門的相對豐度較D30 組(4.36%)高。

圖4 門水平上瘤胃上皮細菌的相對豐度Figure 4 Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on phylum level

由圖5可知：羔羊瘤胃上皮細菌中，普雷沃氏菌屬Prevotella、彎曲桿菌屬Campylobacter、歐陸森氏菌屬Olsenella和擬桿菌屬Bacteroides為優(yōu)勢菌屬，其中普雷沃氏菌屬Prevotella所占比例為25%。

圖5 屬水平上瘤胃上皮細菌的相對豐度Figure 5 Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on genus level

Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗獲得的組間總體差異結果顯示(圖6)：與D30 組羔羊相比，D45 組羔羊瘤胃上皮彎曲桿菌屬和腸單胞菌Intestinimonas的相對豐度顯著降低(P＜0.05)，擬桿菌屬和小桿菌屬Dialister的相對豐度有降低的趨勢(P=0.083)；而薩頓氏菌屬Suttonella、脫硫弧菌屬Desulfobulbus和單胞菌屬Brachymonas的相對豐度顯著增加(P＜0.05)，琥珀酸菌屬Succiniclasticum有增加的趨勢(P=0.083)。

圖6 瘤胃上皮微生物屬水平上的差異菌屬Figure 6 Differences of ruminal epithelial bacteria on genus level

結合瘤胃揮發(fā)性脂肪酸、瘤胃乳頭長度和寬度[7]，與瘤胃上皮微生物進行相關性分析發(fā)現(xiàn)(圖7)：薩頓氏菌屬與瘤胃揮發(fā)性脂肪酸呈正相關(P＜0.05)，擬桿菌屬、琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬Ruminococcus和奇異菌屬Atopobium與瘤胃乳頭長度呈負相關(P＜0.001)，琥珀酸菌屬與瘤胃乳頭寬度呈正相關(P＜0.001)。

圖7 瘤胃上皮細菌與表型變量的相關分析Figure 7 Coefficients for major ruminal epithelial bacterial genera and phenotypic variables

3 討論

反芻動物瘤胃內(nèi)細菌可分為3 個不同的亞群，包括瘤胃內(nèi)容物細菌、飼料顆粒細菌和瘤胃上皮細菌，這3 種細菌種群在瘤胃內(nèi)相互影響相互作用[8]。然而，與另外2 個種群相比，瘤胃上皮細菌因其較低的密度(占總菌數(shù)的1%～2%) 而研究較少[9]。據(jù)報道：瘤胃上皮相關菌群在分類鑒定和功能上與瘤胃內(nèi)容物細菌群存在明顯差異[2,10]。SADET-BOURGETEAU等[11]研究發(fā)現(xiàn)：瘤胃上皮菌群在飼喂高精料和粗飼料間不存在顯著差異，推斷與瘤胃內(nèi)容物細菌群相比，瘤胃上皮菌似乎更加穩(wěn)定。HU 等[12]研究限飼對懷孕母羊影響時，發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮菌群較為穩(wěn)定，不受限飼影響。新生動物瘤胃上皮發(fā)育特征在宿主代謝、免疫應答和瘤胃發(fā)育中起著重要作用，因此瘤胃上皮細菌定植對微生物群與宿主的關系具有重要意義，可影響宿主的早期發(fā)育和健康[13]，甚至對成年后的表現(xiàn)和健康產(chǎn)生持久的影響[14-15]。楊斌[1]研究表明：日齡10 d 羔羊瘤胃上皮已有豐富的微生物定植，微生物多樣性已經(jīng)建立。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著日齡的增加，日齡45 d 組羔羊瘤胃上皮細菌的多樣性較日齡30 d 組更為豐富，且各自具有獨特的菌群，這一結果與JIAO等[13]的結論一致。JIAO 等[13]探究了5 個日齡(0、7、28、42 和70 d)山羊瘤胃上皮菌群的定植情況，結果發(fā)現(xiàn)每個日齡組的山羊瘤胃上皮都有其獨特的菌群，且高日齡組的山羊瘤胃上皮菌群較低日齡組的更為多樣化，這與瘤胃內(nèi)容物的微生物定植過程相似[16-17]。MAO 等[17]研究指出：日齡45 d 羔羊瘤胃內(nèi)容物細菌的OTU 數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)均高于日齡30 d 羔羊。

厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門三大菌門是湖羊瘤胃上皮的主要菌門，這與SCH?REN 等[18]、PETRI 等[19]、JIAO 等[13]報道的反芻動物瘤胃上皮微生物的主要菌門一致。ANDERSON 等[20]研究指出：厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門在門水平上相對豐度可達79.70%。盡管某些細菌的豐度隨年齡的變化而變化，但它們在所有日齡中均存在，說明這些細菌是湖羊瘤胃上皮微生物區(qū)系的核心菌群。LIU 等[21]研究發(fā)現(xiàn)：飼喂開食料顯著降低了變形菌門的相對豐度，這一菌門的許多成員主要負責蛋白質(zhì)降解和固氮的作用[22]。JIAO 等[13]研究發(fā)現(xiàn)：隨著日齡的增加，山羊瘤胃上皮中變形菌門的相對豐度顯著降低，可能與母乳的攝入降低和精料開食料的投入有關。本研究中，2 個日齡組變形菌門的相對豐度并不存在顯著差異，可能原因是2 組羔羊的飼喂方式相同，且采食量無顯著差異[6]。同樣，瘤胃內(nèi)容物菌群結果也顯示：4 個主要菌門在2 個日齡組不存在顯著差異[17]。

屬水平上，普雷沃氏菌屬、彎曲桿菌屬和歐陸森氏菌屬三大菌屬是湖羊瘤胃上皮的優(yōu)勢菌屬。這一結果與LIU 等[21]的研究結果一致，且發(fā)現(xiàn)彎曲桿菌屬在日齡45 d 組相對豐度顯著降低。彎曲桿菌屬是革蘭氏陰性菌，在奶牛、綿羊以及山羊的腸道中定植[23]。JIAO 等[13]發(fā)現(xiàn)：日齡42 d 的山羊羔羊瘤胃上皮彎曲桿菌屬占優(yōu)勢，其相對豐度可達20.33%。INGLIS 等[24]和KRUEGER 等[23]均研究指出：與飼喂精飼料相比，飼喂粗飼料，可從牛的瘤胃中分離出較多的彎曲桿菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著日齡的增加，小桿菌屬相對豐度有下降趨勢。小桿菌屬能夠分解糖類，所包含的菌種常在口腔內(nèi)被檢測到[25-26]，同時，小桿菌屬也在瘤胃中出現(xiàn)[27-28]。研究表明：口腔中小桿菌屬含量的增加與唾液減少有關[29]，這提示瘤胃上皮小桿菌屬相對豐度的減少可能與瘤胃的緩沖能力和液體周轉有關[1,28]。JIAO 等[13]研究指出：日齡70 d 羔羊瘤胃上皮中脫硫弧菌屬是優(yōu)勢菌屬，相對豐度達3.78%。有研究認為：脫硫弧菌屬與硫的還原和丙酸的生成有關[30]，琥珀酸菌屬雖然不能發(fā)酵碳水化合物和氨基酸，但能將琥珀酸鹽轉化為丙酸[31]，然而本研究中脫硫弧菌屬和琥珀酸菌屬的豐度與丙酸水平[6]呈相反的變化。

本研究表明：薩頓氏菌屬與瘤胃揮發(fā)性脂肪酸呈正相關，擬桿菌屬、琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬和奇異菌屬與瘤胃乳頭長度呈負相關，而琥珀酸菌屬與瘤胃乳頭寬度呈正相關，說明這些菌可能參與揮發(fā)性脂肪酸的代謝以及瘤胃組織的發(fā)育。此外，也有研究認為：特異的微生物通過促炎和抗炎途徑及上皮細胞介導的信號來調(diào)節(jié)宿主的免疫反應[32]。

4 結論

日齡45 d 組羔羊瘤胃上皮細菌群落多樣性較日齡30 d 組更為豐富，且2 個日齡組有各自不同的微生物區(qū)系，提示不同日齡羔羊的瘤胃上皮細菌定植存在差異，且通過相關性分析表明：這些菌群參與了瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的代謝與瘤胃乳頭的發(fā)育。