毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物及土壤浸提液對浙貝母的化感作用

吳海平，葉根華，李偉成

（1.國家林業和草原局 華東調查規劃院，浙江 杭州 310019；2.松陽縣生態林業發展中心，浙江 麗水 323400）

植物化感作用對其生態功能以及植物之間、植物與環境之間的關系產生重要影響[1]。探討生態系統中種群間相互干擾和物種進化之間的關系是目前化感研究領域的熱點[2]。除了制約其他物種的生長，植物產生化感作用的化學物質還具有如調節植物養分吸收和土壤生物群落、影響凋落物分解過程和土壤肥力等作用[2-4]。因此，探討化感作用有助于深入地理解和解釋竹林生態系統中植物組成分布、群落演替、協同進化及入侵等效應[5]。

毛竹Phyllostachysedulis是常綠喬木狀竹類植物。毛竹的不同器官和毛竹林土壤浸提液含有不同化感物質，不同質量濃度的浸提液對其他物種生長及種子萌發產生抑制或促進效應[5-8]。從植物化感作用入手，充分利用毛竹林生態系統中化感物質的正效應，避免負效應，探尋合理的毛竹林立體經營模式具有較好的實踐意義。

林藥復合經營模式可利用林下生態群落學的生態位和空間結構原理，把竹類、灌木、草本等合理配置，形成多層次和多種群的健康生態系統。高效的毛竹-藥用植物復合經營模式需要探索與其相適應的林下伴生物種。本研究選擇大宗藥材浙貝母Fritillariathunbergii為目標植物，探討毛竹不同器官及林內土壤的化感作用，為在毛竹林下和林窗發展林藥復合經營的森林生態系統提供參考和技術支撐。

1 研究區與方法

1.1 研究區概況

研究區設在浙江省磐安縣大盤山博物館(28°49′N，120°17′E)。該區域屬于亞熱帶季風氣候，多年平均氣溫為 13.9～17.4 ℃，1月最低平均氣溫為4.3 ℃，7月最高平均氣溫為 28.8 ℃，無霜期短，雨量充沛，多年平均降水量為 1 409.8～1 527.8 mm。

1.2 浸提母液制備

于2019年9月在集約經營毛竹林內采集徑級為0～5 mm 的根系、3年生植株的新鮮枝葉、林下凋落物和0～20 cm 土壤作為制備浸提液的材料。其中：根系的取材半徑為以竹篼為中心的0.5 m 范圍內；新鮮枝葉取第6 盤枝的3 級枝和葉片；采集凋落物的范圍與根系相同，盡量采集完整并去除雜質。

0～5 mm 徑級根系放置陰涼處風干；將新鮮枝葉洗凈，均剪成1 cm 左右的小段；凋落物混合均勻后從葉端開始向另一端剪碎，寬約1 mm；林下0～20 cm 鮮土樣風干，研碎，過2 mm 篩。取1 g 上述4 種材料，加10 mL 蒸餾水在室溫[(26±1.2) ℃]下浸泡48 h 后進行3 重過濾：先用4 層棉紗布過濾，再用普通濾紙過濾，然后用0.45 μm 的微孔濾膜過濾。4 ℃消毒后置于冰箱。

1.3 試驗設計

以蒸餾水作空白對照(ck)，將不同浸提液用蒸餾水稀釋成0.005 kg·L-1(T1)、0.010 kg·L-1(T2)、0.020 kg·L-1(T3)、0.050 kg·L-1(T4)和0.100 kg·L-1(T5) 等5 個質量濃度并相應設置5 個處理[9]。9月，選取無病蟲害、顆粒飽滿、大小均一的浙貝母塊莖(10.9±1.12) g，選用直徑30 cm、高30 cm 的圓柱形控根容器種植，每盆種植3 顆浙貝母塊莖，穴距10 cm，呈等邊三角形；每個處理設置5 個重復，即5 盆共15 株，處理間所選用的塊莖質量無顯著差異。土壤為沙壤土，并混入竹炭肥100 g，攪拌均勻。竹碳肥理化性質：pH 5.6，全氮為(1.48±0.11) g·kg-1，全磷為(1.32±0.20) g·kg-1，全鉀為(26.15±4.06) g·kg-1。將埋置塊莖后的控根容器放置于大田，進行90 d 的適應生長。隨后隔15 d 澆浸提液1 次，每次每盆澆200 mL，處理期為90 d，期間進行常規管理。

1.4 參數測定

于2020年4月選取植株上部成熟、無病蟲害葉片，采用Li-6400 便攜式光合儀測量光合特征參數。設置光照強度梯度為0、20、60、100、200、400、800、1 200、1 600 μmol·m-2·s-1，選擇晴朗無風的天氣于9:00—11:00 采用內置紅藍光源測定植株光響應曲線。人工二氧化碳摩爾分數控制為400 μmol·mol-1，相對濕度約為70%。

用直尺測量浙貝母的高度，每個處理10 株，并將這10 株取回實驗室分根、莖、葉放入烘箱中105 ℃殺青30 min 后80 ℃烘至恒量，用天平稱其質量。采用剪紙稱量法計算葉面積[7]。

在每個處理中，選取剩余5 株浙貝母植株同一方向的上、中、下層葉片各3 片，混合后采用徐琳煜等[9]的方法提取光合色素，用紫外分光光度計測定波長為665、649、470 nm 處的吸光度。同時，每個處理選取成熟度相近中下層的葉片10 片，放入干冰中迅速帶回實驗室，放-80 ℃冰箱備用。葉片過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)質量摩爾濃度均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

采用王文文等[10]和車朋等[11]的方法測定浙貝母的貝母素甲和貝母素乙。色譜條件：采用ELSD 檢測器檢測，色譜柱為 Supersil ODS2 (4.6 mm×25 cm) E1828368。流動相：偶氮二環己基甲腈(AcCN)∶0.05%三乙胺溶液為75∶25，壓力為10.0 MPa，流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。依次檢測對照品和供試品溶液，并計算貝母素甲和貝母素乙的質量分數。

1.5 數據處理

采用SPSS 19.0 的非直角雙曲線模型擬合光合—光響應曲線，依據光響應曲線計算得出表觀量子效率、最大凈光合速率、光飽和點和光補償點。

化感效應指數IR=1-C/T(T≥C)或IR=T/C-1(T＜C)。其中：T為試驗值，C為對照值。IR＞0 表示促進作用，IR＜0 表示抑制作用[12]。綜合化感效應指數用浙貝母的生長指標、光合色素和光響應特征參數的化感效應指數的算術平均值表示。

采用SPSS 19.0 進行單因素方差分析及最小顯著差異法(LSD 法)檢驗(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母生長的影響

化感效應指數表明：毛竹根系、新鮮枝葉、凋落葉和土壤浸提液對浙貝母株高的影響表現為低質量濃度促進高質量濃度抑制(“低促高抑”)的效應(表1)，在T5處理時均表現出抑制浙貝母高生長的現象；凋落物和土壤浸提液處理時，分別從T3、T4處理開始發生抑制作用。差異顯著性分析表明：新鮮枝葉和凋落物浸提液處理對浙貝母株高的影響不顯著。

表1 毛竹不同浸提液對浙貝母株高、生物量和葉面積的影響Table 1 Effects of different extracts of Ph. edulis forest on height of F. thunbergia

除根系浸提液外，其他浸提液處理對浙貝母地上生物量的影響均表現為促進效應，促進程度隨浸提液質量濃度的增加先升高后降低，且凋落物和土壤浸提液均在T2處理時地上生物量最大，在T5處理時最小(表1)。根系浸提液處理對浙貝母的地上和地下生物量的影響均表現為“低促高抑”的雙重效應，均在T2處理時促進作用較為明顯，T5處理時表現出抑制效應；新鮮枝葉浸提液對浙貝母地下生物量的影響不顯著，對其地上生物量的影響在T2～T4處理時顯著(P＜0.05) 高于ck；凋落物浸提液處理時，T2處理地上部分生物量顯著(P＜0.05)高于ck，而地下生物量在T1～T3處理時顯著(P＜0.05)高于ck；土壤浸提液對地上生物量的影響在T2處理時顯著(P＜0.05)高于ck。

毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母葉面積的影響均無顯著性差異(表1)。但化感效應指數表明：除了根系浸提液的T5處理外，其他浸提液對葉面積有促進作用，趨勢為隨著浸提液質量濃度的增加先升高后降低，除凋落物浸提液外，均在T2處理時葉面積最大，但各處理組間差異性均不顯著，表明毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母葉面積的影響不大。根系浸提液處理時對浙貝母葉面積的影響表現為“低促高抑”的效應。

2.2 毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母光合色素和光響應特征的影響

化感效應指數表明：除了根系浸提液的T5處理，不同浸提液對浙貝母的葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素a+b 質量分數均有促進作用，隨浸提液質量濃度增加呈現先升高后降低的趨勢，且均在T5處理時質量分數最低。葉綠素a/b 數值則隨浸提液質量濃度的增加而增加(根系浸提液除外)，根系各處理間的差異不顯著(表2)。毛竹根系浸提液處理時，葉綠素a 和葉綠素a+b 均表現為低質量濃度促進高質量濃度抑制的效應，而葉綠素b 和類胡蘿卜素質量分數均有不同程度提高。新鮮枝葉浸提液處理時，葉綠素b 和類胡蘿卜素質量分數表現為“低促高抑”的雙重效應，這與凋落物浸提液處理時趨同。土壤浸提液處理時，對光合色素參數均有不同程度的提升作用(除了類胡蘿卜素表現為“低促高抑”)，浙貝母光合色素質量分數隨浸提液質量濃度的增加而降低。

表2 毛竹不同浸提液對浙貝母光合色素參數的影響Table 2 Effects of different extracts of Ph. edulis forest on the photosynthetic pigment of F. thunbergia

除根系浸提液外，其他3 種浸提液處理對浙貝母的最大凈光合速率基本表現為促進作用，均提高浙貝母的表觀量子效率和降低光補償點，表明毛竹根系、枝葉、凋落物和土壤浸提液處理影響了浙貝母的光合代謝速率，提升了其對環境的生長適應能力(表3)。根系浸提液處理時，T5處理的光飽和點與光補償點分別比ck 降低了53%和50%，化感指數分別為-0.530 和-0.500。新鮮枝葉浸提液處理時，浙貝母的光飽和點隨浸提液質量濃度的增加呈現出先升高后降低的趨勢，光補償點與ck 差異不顯著。凋落物浸提液處理時，T1處理的光飽和點顯著(P＜0.05)高于ck，T2～T4處理均顯著(P＜0.05)低于ck。土壤浸提液處理時，表觀量子效率隨著浸提液質量濃度升高而降低，而光飽和點和光補償點的值均在T1處理時最低。

表3 毛竹不同浸提液對浙貝母光響應特征參數的影響Table 3 Effects of different extracts of Ph. edulis forest on photoresponse characteristic parameters of F. thunbergii

2.3 毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母的綜合化感效應

綜合化感效應表明：除根系浸提液外，其他3 種浸提液對浙貝母的化感效應均表現為不同程度的促進作用，浸提液質量濃度越高促進作用越弱(表4)。根系浸提液對浙貝母的化感效應則表現為“低促高抑”，T5有一定的抑制效應，這與其生長指標和光合生理指標的研究結果一致。根系浸提液對浙貝母的綜合平均化感效應指數為0.103，土壤浸提液對其化感效應最弱，平均化感效應指數為0.056。4 種浸提液的綜合化感效應指數從大到小依表現為根系浸提液、新鮮枝葉浸提液、凋落物浸提液、土壤浸提液。

表4 毛竹不同浸提液對浙貝母的綜合化感效應Table 4 Synthesis effects of different extracts of Ph. edulis forest on F. thunbergia

2.4 毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母抗氧化酶及丙二醛的影響

毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對過氧化氫酶的影響表現為隨著浸提液質量濃度的增加，呈現先升高后降低的趨勢，表明中低質量濃度的4 種浸提液提高了浙貝母葉片的過氧化氫酶活性(圖1)。根系浸提液處理時，T2和T3的過氧化氫酶活性顯著(P＜0.05)高于ck。新鮮枝葉和凋落物浸提液的過氧化氫酶活性在T3時顯著(P＜0.05)高于ck。土壤浸提液處理時，T2、T3、T4的過氧化氫酶活性顯著(P＜0.05)高于ck。

圖1 毛竹不同浸提液對浙貝母抗氧化酶活性和丙二醛的影響Figure 1 Effects of different extracts of Ph. edulis forest on the activities of antioxidant enzymes and MDA content of F. thunbergii

根系浸提液處理時，T5顯著(P＜0.05)增加了過氧化物酶活性。新鮮枝葉浸提液處理時，過氧化物酶活性隨浸提液質量濃度的增加表現為先升高后降低，其中T4顯著(P＜0.05)高于ck。凋落物浸提液處理時，T2的過氧化物酶活性顯著(P＜0.05)高于ck。土壤浸提液處理時，過氧化物酶活性隨浸提液質量濃度的增加而增加，T3、T4、T5顯著(P＜0.05)高于ck。

毛竹不同浸提液對超氧化物歧化酶活性的影響表現為隨著浸提液質量濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，這與過氧化氫酶類似。根系和凋落物浸提液處理時，T2、T3、T4的超氧化物歧化酶活性顯著(P＜0.05)高于ck。新鮮枝葉和土壤浸提液處理時，各處理組與ck 的差異不顯著。

毛竹不同浸提液處理對丙二醛質量摩爾濃度的影響有差異。根系浸提液處理時，丙二醛質量摩爾濃度隨浸提液質量濃度的增加而增加，T4、T5顯著(P＜0.05)高于ck。新鮮枝葉和凋落物浸提液處理時，各處理組的丙二醛質量摩爾濃度與ck 差異不顯著。土壤浸提液處理時，丙二醛質量摩爾濃度隨浸提液質量濃度的增加表現為先增加后降低，T1顯著(P＜0.05)高于ck。

2.5 毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母藥效成分質量分數的影響

浙貝母的貝母素甲和貝母素乙是其主要生物堿藥效成分。隨著毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物及土壤浸提液質量濃度的增加，貝母素甲和貝母素乙質量分數表現為先升高后下降(表5)。除根系浸提液處理外，其他浸提液對貝母素甲和貝母素乙質量分數的影響均表現為促進效應。貝母素甲和貝母素乙質量分數分別在根系浸提液的T3和T4時顯著(P＜0.05)小于ck。

表5 毛竹不同浸提液對貝母素甲和貝母素乙質量分數的影響Table 5 Effects of different extracts of Ph. edulis forest on the contents of fritillarin A and fritillarin B

3 討論

植物的株高、生物量和葉面積等生長參數是反映化感作用最直觀的指標[6,13]。研究表明：化感作用強度與化感物質的種類、來源、含量以及目標植物對其的敏感程度有關[5,14-15]。本研究發現：毛竹新鮮枝葉、凋落物及土壤浸提液對浙貝母的生長有積極作用，這與毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物及土壤浸提液對塊莖類草本藥用植物延胡索Corydalisyanhusuo株高、地上部分、地下部分和葉面積影響表現為“低促高抑”的結果不同[7]，也有別于毛竹浸提液對苦櫧Castanopsissclerophylla幼苗的株高和地徑的試驗結果[5]，本研究中高質量濃度毛竹新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液抑制浙貝母高生長的同時能促進地上、地下生物量的積累。

光合色素是光合作用過程中的重要物質，葉綠素質量分數的變化是植物對化感作用響應的最直接的表現形式之一[16]。本研究發現：毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對浙貝母光合色素的影響均隨浸提液質量濃度的增加先升后降，除根系浸提液T5外，其他處理的所有光合色素均值都大于ck。這與黃永杰等[16]用水花生Alternantheraphiloxeroides浸提液處理馬尼拉草Zoysiamatrella的結果不同，與張瑞等[7]用毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液處理延胡索的結果亦有差異。本研究中，浙貝母葉綠素a、葉綠素b 增加且葉綠素b 的增量超過了葉綠素a，表明浸提液處理提高了浙貝母直射光吸收的同時亦大大提高了漫射光(藍紫光)的吸收，增加其能量的積累，有利于浙貝母生長；而葉綠素a/b 表明浙貝母具備中性植物的特點，在將來的復合經營體系中能較好地適應和利用毛竹林下(林窗)環境。

光合作用是化感物質影響植物生長的重要途徑[17]。本研究發現：毛竹新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液處理使浙貝母對光能的利用能力和吸收能力增強；同時，毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液不同程度提高了浙貝母的表觀量子效率，降低了光補償點，且在高質量濃度浸提液處理下降低光飽和點，表明毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液促進了浙貝母對弱光的吸收，使之適應了光環境的變化。浙貝母在適應弱光環境的同時增加最大光合速率，可以在光合生理生化過程中最大程度地利用自身可塑性適應環境，最優化攝取環境資源。這與浸提液處理后浙貝母的生長指標、光合色素變化以及化感綜合效應值的結果一致。本研究的結果與陳娟等[5]利用不同毛竹浸提液降低了苦櫧對光能的利用效率的結果不同，原因可能是化感作用依賴于浸提液質量濃度、測試物種和化感物質的來源[3]。浙貝母在毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液處理下的這一光合特性十分重要。毛竹屬于典型的大型克隆植物，處于拋荒和自然發育的毛竹林更是具有強大的入侵擴張能力，能建立高郁閉度的單優群落。浙貝母屬于淺根系的早春植物，通過吸收由毛竹葉片淋溶、凋落物分解和土壤微生物發育等方式釋放到環境中的化感物質，來提高毛竹林隙和林下弱光的利用率，以利于生存、生長和發育。這是浙貝母與毛竹建立復合經營體系的優勢。

植物抗氧化能力的提高是植物在脅迫環境下生存的重要保障。在本研究中，毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液對抗氧化酶的影響基本表現為先升高后下降，表明毛竹浸提液在一定質量濃度范圍內可以提升浙貝母的抗氧化能力。這可能與毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液具有抗氧化性、清除自由基的能力有關[18]，亦有可能是其含有激活過氧化氫酶相關基因表達的物質[19]，同時，中低質量濃度毛竹根系浸提液可以促進過氧化氫酶活性，提高浙貝母的抗逆性。亦有研究表明，不同物種在不同脅迫類型的影響下，其過氧化氫酶活性表現出提升、無影響和下降的現象[19]，因此植物在應對脅迫時有多種途徑和策略可以選擇[20]。高質量濃度毛竹根系浸提液處理時，增加了浙貝母丙二醛質量摩爾濃度，說明高質量濃度毛竹根系浸提液對浙貝母產生了一定的傷害，限制了浙貝母生長，這與其生長指標的研究結果一致。土壤浸提液處理對浙貝母丙二醛質量摩爾濃度影響不一致。T1處理時浙貝母丙二醛質量摩爾濃度顯著高于ck，表明T1脅迫程度在其承受范圍之內，所以浙貝母的抗氧化系統能迅速清除其體內過多的活性氧自由基，保護浙貝母的生理功能免受傷害。新鮮枝葉和凋落物浸提液處理時，浙貝母丙二醛質量摩爾濃度與ck 之間沒有顯著差異，這與陳昱等[20]在芥菜Brassicajuncea浸提液對豇豆Vigna unguiculata幼苗的抗氧化酶活性的影響結果相似。可見，毛竹林化感物質對浙貝母丙二醛的影響不大，但提高了浙貝母葉片的抗氧化酶活性，從而促進了浙貝母的生長。

在毛竹根系、新鮮枝葉、凋落物和土壤處理下，浙貝母的主要藥效成分貝母素甲和貝母素乙的變化與其生長指標、光合生理、抗性生理的表現趨同，所有浸提液(中、高質量濃度的根系浸提液除外)均有增加藥效成分的效應，這種效應為竹藥復合經營提供了基礎。高質量濃度毛竹根系浸提液對浙貝母生長有一定的抑制作用亦體現在其藥效成分上，而其他3 種浸提液特別是新鮮枝葉浸提液對藥效成分的提升較為明顯，原因可能是竹葉具有豐富的黃酮類化合物、酚酸類化合物、蒽醌類化合物等活性成分[18]。

4 結論

浙貝母具備中性植物的特性，可適應0.005～0.100 kg·L-1的毛竹新鮮枝葉、凋落物和土壤浸提液澆灌處理。上述3 種浸提液提高了浙貝母的生物量、葉面積、光合色素、弱光環境適應能力和藥效成分等，但高質量濃度毛竹根系浸提液對浙貝母有一定的限制作用。在實際生產經營中，可以在毛竹林中適當開辟林窗和林隙，整地挖除根鞭后栽培浙貝母。