桂花OfACOs基因家族鑒定及表達分析

張 耀，王家璇，蔡 璇,2，曾祥玲,2，楊 潔,2，陳洪國,2，鄒晶晶,2

（1.湖北科技學院 國家林業(yè)草原桂花工程技術研究中心，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市高新桂花產(chǎn)業(yè)技術研究院，湖北 咸寧 437100）

桂花Osmanthusfragrans為木犀科Oleaceae 園林觀賞植物，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，桂花樹形優(yōu)美、葉色青翠、香味馥郁，在園林中應用廣泛[1]。目前，桂花在食品、化妝品和藥品中的應用已經(jīng)逐漸成熟[2]，新興的桂花香水、乳液、香熏和精油等高檔化妝品也逐漸打開市場[3-5]。然而，桂花花期較短，最佳觀賞期和采收期僅2～3 d，極大地限制了其觀賞價值與經(jīng)濟價值[6-7]。

已有研究證明：OfABFs 基因可能參與調控桂花花瓣衰老[8]；蔣琦妮等[9]研究發(fā)現(xiàn)：桂花OfAP1 基因在桂花成花轉變、花芽分化和發(fā)育中有重要作用。向其柏等[10]研究發(fā)現(xiàn)：許多經(jīng)濟采收價值較高的桂花品種對乙烯敏感，非授粉誘導的內源乙烯躍變是其衰老的重要調控因子。朱誠等[11]研究表明：盛花末期乙烯釋放量的迅速增加及膜脂過氧化程度加劇是導致‘薄葉金桂’O.fragrans‘Baoye Jingui’衰老的主要生理原因。ZHOU 等[12]發(fā)現(xiàn)：外源乙烯利處理明顯加速‘厚瓣金桂’O.fragrans‘Houban Jingui’和‘柳葉金桂’O.fragrans‘Liuye Jingui’的衰老，而乙烯抑制劑硫代硫酸銀則延長了其觀賞壽命。ZOU 等[6]發(fā)現(xiàn)‘柳葉金桂’內源乙烯躍變峰的出現(xiàn)與花瓣褐化、脫落等衰老特征同時發(fā)生，外源乙烯處理不僅明顯加速了切花花瓣的萎蔫和脫落，還導致花瓣細胞中央大液泡破裂、各細胞器扭曲擠縮變形，加劇了 DNA 斷裂，降低了抗氧化酶活性，增加了超氧自由基的激發(fā)和膜脂過氧化程度。由此可見：桂花是乙烯敏感型花卉，乙烯參與了其花瓣衰老過程中花瓣脫落和萎蔫、細胞結構變化、氧化還原系統(tǒng)及核酸降解等多個過程的調節(jié)，是桂花衰老的重要調控因子。然而，尚不清楚該過程中內源乙烯合成途徑。

氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase,ACO)作為乙烯生物合成途徑中的最后一個關鍵酶，直接催化乙烯的合成，被認為是高等植物中乙烯應答的主要標志[13]。ACO 早期被ADAMS 等[14]發(fā)現(xiàn)，并命名為乙烯形成酶，后來發(fā)現(xiàn)需要抗壞血酸和氧作為輔助底物，因此稱為ACC 氧化酶。目前，ACO 基因家族在多個物種中都有研究，SORNCHAI 等[15]通過導入石斛DendrobiumCpACO基因延長了其花期；有研究表明：楊樹PopulusACO 基因參與調節(jié)林木莖的生長發(fā)育[16]。植物ACO 基因的表達受到生長素、干旱以及鹽脅迫的抑制[17]；番茄Lycopersiconesculentum、花椰菜Brassicaoleraceavar.botrytis的ACO 基因表達受脫落酸、外部機械損傷和低溫的誘導[18]。在擬南芥Arabidopsisthaliana中[19]，ACO1 受多種信號調控，影響植株的乙烯產(chǎn)量。然而，目前桂花中還未見相關基因的報道。本研究以‘柳葉金桂’為試材，利用生物信息學方法和工具對桂花OfACOs 家族進行鑒定、進化分析、基因結構分析、表達模式分析等，為進一步探索桂花花瓣衰老機制以及提高桂花園林賞花價值與經(jīng)濟價值提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

‘柳葉金桂’花瓣采自華中農(nóng)業(yè)大學校園內。分別采集不同開花階段的桂花花瓣，稱量后密封，保存在液氮中，立即運送回實驗室，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。參考CHEN 等[20]對桂花開花級數(shù)的劃分體系，將‘柳葉金桂’開花級數(shù)劃分為：①鈴梗期(花苞期，S1)，花朵呈緊閉的花苞狀，未展開；②初花期(S2)，花朵微張，呈半開放狀態(tài)；③盛花初期(S3)，花瓣進一步展開，夾角為45°～90°；④盛花期(S4)，花瓣完全展開，花藥膨大淺黃色；⑤盛花后期(S5)，花瓣完全展開，花藥萎縮變?yōu)樯詈稚?；⑥脫落?S6)，花瓣失水，部分從樹體上自然脫落。

1.2 方法

1.2.1 桂花OfACOs 基因家族成員的鑒定 ACO 基因家族成員大多含有DIOX-N (PF14226)和2OG-FeIIOxy (PF03171)保守結構域[21]。對‘柳葉金桂’基因進行蛋白質家族數(shù)據(jù)庫(pfam)保守結構域注釋，以注釋到PF03171 和PF14226 保守結構域的基因作為OfACOs 基因家族候選基因，再通過蛋白結構域搜索(NCBI Conserved Domain Search Service) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)[22]進一步驗證候選基因的PF03171 和PF14226 結構域。

1.2.2 進化樹分析 登錄擬南芥官網(wǎng) (www.arabidopsis.org) 下載擬南芥AtACO 基因序列信息。利用MUSCLE[23]比對各基因多序列，采用鄰接算法進行系統(tǒng)進化樹聚類分析。

1.2.3 基因全家族鑒定及染色體定位 對‘柳葉金桂’基因進行pfam 保守結構域注釋，獲取OfACOs成員序列信息及其在各染色體上的定位信息，然后使用Mapchart (2.32)[24]繪制染色體上的ACO 基因。

1.2.4 基因結構與保守Motif 分析 利用 MEME 軟件( Suite version 5.0.2，http://meme-suite.org/) 對 OfACOs保守基序進行預測分析，設置Motif 個數(shù)為15 個。根據(jù)基因注釋的gff 文件，利用TBtools (v1.098775)[25]對基因結構、Motif 進行可視化。

1.2.5 共線性分析 為分析OfACOs 基因家族成員的重復關系，通過使用blast (2.11.0+)和MCScanX[26]對家族成員進行共線性分析，使用默認參數(shù)輸出數(shù)據(jù)，結果使用circos (0.69)圈圖展示。此外，下載了擬南芥ACO 基因家族成員的基因注釋文件，通過使用blast (2.11.0+)和MCScanX 對家族成員進行共線性分析，使用默認參數(shù)輸出數(shù)據(jù)，結果使用circos (0.69)圈圖展示。

1.2.6 OfACOs 不同組織器官表達模式分析 從美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫下載桂花在根、莖、葉及不同開花階段等組織部位的轉錄組測序數(shù)據(jù)(PRJNA679852)，以基因表達量量化指標(FPKM)計算基因表達水平值，用 TBtools[25]對數(shù)據(jù)可視化。

1.2.7 OfACOs 不同開花階段的表達分析 取S1～S6 不同開花階段的桂花花瓣，按HiPure Universal RNA Kit 提取試劑盒說明提取桂花花瓣RNA。用StarScript II RT Kit 反轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，稀釋10 倍備用。利用染料法(SYBR) 預混2×RealStar Fast 在ABI 7500 系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,Inc.)進行實時熒光定量PCR 分析(RT-qPCR)。RT-qPCR 體系為10.0 μL 2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix，上下游引物各0.8 μL，2.0 μL cDNA，6.4 μL ddH2O。RT-qPCR 的反應程序為：94 ℃ 30 s；40 個循環(huán)：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s。以ACTIN作為內參，采用 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，每個組織每個基因設3 個重復。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每個試驗的每個處理進行3 次生物學重復。數(shù)據(jù)為平均值 ± 標準誤。所有數(shù)據(jù)用SAS v.8.0 進行方差分析和多重比較分析，在0.05 水平上進行鄧肯氏多重比較。

2 結果與分析

2.1 OfACOs 基因鑒定及染色體定位

通過pfam 數(shù)據(jù)庫PF03171 和PF14226 保守結構域注釋分析，從桂花基因組中共鑒定到122 個OfACOs 基因家族成員(圖1)。這122 個OfACOs 家族成員主要分布于除19 號染色體以外的其他22 條染色體上，其中，1 號14 條、2 號4 條、3 號13 條、4 號4 條、5 號2 條、6 號6 條、7 號和8 號各1 條、9 號7 條、10 號8 條、11 號2 條、12 號5 條、13 號和14 號各3 條、15 號4 條、16 號7 條、17 號3 條、18 號6 條、20 號8 條、21 號和23 號各1 條、22 號11 條。其中1 號染色體上基因最多，7 號、8 號、21 號和23 號染色體上分布最少。

圖1 桂花OfACOs 基因家族的染色體定位Figure 1 Chromosomal localization of OfACOs gene family in O. fragrans

用桂花OfACOs 和擬南芥AtACOs 構建進化樹，結果如圖2所示。通過系統(tǒng)聚類，大致將OfACOs 分為7 組，其中擬南芥基因AT1G05010、AT1G62380、AT1G77330、AT2G19590 和AT1G12010與桂花LYG005871、LYG00776 等21 個OfACOs 共存于第3 組中。其他組不存在擬南芥AtACOs基因。通過擬南芥官網(wǎng)查找發(fā)現(xiàn)這5 個基因都具有促進乙烯生成的功能。

圖2 桂花與擬南芥ACOs 基因進化分析Figure 2 Phylogenetic analysis of ACOs in O. fragrans and A. thaliana

2.2 桂花OfACOs 基因家族結構及保守基序分析

進一步對桂花122 個OfACOs 進行基因結構和保守基序分析(圖3)。基因結構編碼區(qū)(CDS)、非翻譯區(qū)(UTR) 分析結果表明：OfACOs 基因的CDS 數(shù)量為2～11 個，其中52 個成員含有3 個CDS 區(qū)(42.6%)，41 個成員含有4 個CDS 區(qū)(33.6%)。其中LYG025988、LYG018295、LYG001228、LYG001225、LYG028156 和LYG030913 的CDS 區(qū)分布較散。LYG000315 是CDS 區(qū)最多的基因。

圖3 桂花OfACOs 基因結構及蛋白質保守結構域Figure 3 Gene structure and conserved motifs analysis of OfACOs in O. fragrans

對122 個OfACOs 的氨基酸序列進行保守基序分析表明：OfACOs 的Motif 為4～25 個，其中，LYG022698 為最少，只有4 個Motif，而LYG028155 有25 個Motif；24 個OfACOs 成員含有14 個Motif，且其中有11 個的Motif 構成完全相同，都位于第3 組中；幾乎所有的OfACOs 成員中都含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4 和Motif 7，表明在桂花OfACOs 家族中這5 個Motif 的保守性更高。

2.3 桂花OfACOs 共線性分析

基因組內共線性分析結果(圖4A)表明：染色體復制事件發(fā)生在桂花的22 條染色體上，OfACOs 共存在394 對染色體共線性對，其中1 號染色體上最多，有84 對，說明該基因家族可能發(fā)生了擴張。

圖4 桂花及擬南芥ACO 基因家族共線性分析Figure 4 Collinearity analysis of ACO gene family in O. fragrans and A. thaliana

桂花與擬南芥ACO 基因家族的共線性分析表明：擬南芥的2 條染色體與桂花的15 條染色體共發(fā)生了41 對染色體復制對，其中擬南芥1 號染色體存在29 對染色體復制對(圖4B)。綜上所述，通過與擬南芥ACO 基因共線性分析，有助于利用擬南芥的基因功能探索桂花OfACOs 中相應基因的功能。

2.4 桂花OfACOs 不同組織部位及開花時期的表達模式分析

具有相同的DIOX-N (PF14226)和2OG-FeII-Oxy (PF03171)保守結構域并不一定能行使相同的蛋白功能。為更準確地篩選OfACOs 蛋白，通過swiss-prot 同源序列對比[27]，篩選出27 個基因家族成員。對27 個OfACOs 成員在根、莖、葉、花芽，以及不同開花階段(S1～S6)進行轉錄組分析。由圖5可知：除去FPKM 小于1 的成員后，在根莖葉花中表達的OfACOs 成員共計17 個。其中，LYG013745、LYG034324、LYG027159、LYG027160 主要在根中微量表達；LYG007706 主要在根、葉和花中表達；LYG007045、LYG030899、LYG036697 主要在莖、葉和花中表達；LYG034328 在葉和花中表達；LYG003688、LYG006223、LYG006760、LYG034327、LYG034329 在根、莖、葉、花中均有表達；LYG034330主要在根、莖、葉中表達；LYG035696 主要在根和花中表達；LYG036707 在開花后期微量表達。

圖5 桂花OfACOs 基因家族在桂花不同組織部位以及不同開花階段中的表達分析Figure 5 Expression profiles of OfACOs gene family in different tissues and different flowering stages of O. fragrans

2.5 不同開花時期OfACOs 表達分析

綜合OfACOs 基因家族在不同組織部位以及不同開花時期的表達量，以在桂花花瓣中明顯表達的成員作為參與乙烯途徑花瓣衰老調控的研究對象，篩選出LYG003688 、LYG006223 、LYG034327、LYG034329、LYG034330、LYG035696、LYG007706、LYG007045、LYG030899、LYG036697、LYG034328、LYG036707等12 個成員，其中LYG006223、LYG-007706、LYG007045、LYG035696 等4 個基因在開花后期(S5 或S6)極顯著差異上調表達。

進一步對這4 個OfACOs 成員進行RT-qPCR 驗證分析(圖6)。結果表明：這4 個成員在開花后期(S5 或S6) 顯著性差異上調表達(P＜0.05)，與轉錄組測序結果一致。

圖6 桂花花瓣候選OfACOs 實時熒光定量PCR 分析Figure 6 RT-qPCR analysis of candidate OfACOs genes in O. fragrans

3 討論

ACO 基因家族是植物的轉錄因子家族之一，在植物乙烯生物合成中發(fā)揮著重要的調控作用[28]。本研究從‘柳葉金桂’的基因組中鑒定出122 個ACO 基因，基因家族總數(shù)量高于普通煙草Nicotiana tabacum(19 個ACO 基因)[29]、杞柳Salixintegra(42 個ACO 基因)[21]、玉米Zeamays(8 個ACO 基因)[30]和甜瓜Cucumismelo(9 個ACO 基因)[17]中的數(shù)量，低于陸地棉Gossypiumhirsutum(332 個ACO 基因)[31]。ACO基因在植物基因組中分布不均勻，如玉米[32]中62.0%的基因主要分布在其中2 條染色體上，普通煙草[29]40.0%的基因主要分布在其中的2 條染色體上。本研究中桂花OfACOs 基因的42.6%主要分布在其中的5 條染色體上，推測可能與基因復制有關。

通過同源序列比對篩選、不同組織部位及開花階段的轉錄組測序分析，最終篩選到4 個在花瓣衰老階段(S5 和S6)顯著上調表達的成員LYG007706、LYG007045、LYG006223、LYG035696。LYG006223 和LYG007045 位于3 號染色體上，LYG007706 位于4 號染色體上。家族內共線性分析發(fā)現(xiàn)：LYG007045 與LYG007706 為一對復制對，可見其保守基序、共線性都有緊密聯(lián)系，可能具有相似的功能。LYG035696家族內進化分析中與LYG006223 聚類較近，兩者可能具有相似的功能。與擬南芥進化分析中，LYG007706與擬南芥5 個基因位于同一個分組內。與擬南芥共線性分析中AT1G12010 與LYG007045 為共線性對；研究表明AT1G12010 參與乙烯生物合成[32]，通過負調控ACC2 的表達來調控擬南芥內源乙烯水平能[33]。AT1G62380 與LYG006223 是一對共線性對 ；LYG007706 不僅與AT1G62380、AT1G12010 共線性，還與AT2G19590 共線性。AT2G19590 能夠通過調控擬南芥乙烯生物合成，調控黑暗中擬南芥幼苗根系發(fā)育[34]。

此外，進化分析及基因結構分析表明：桂花中有16 個OfACOs 成員與擬南芥AtACOs 同時聚類于第3 組中，其中11 個OfACOs 成員的Motif 完全相同，且與擬南芥的AtACOs 含有7 個相同的Motif 基序。通過轉錄組測序及RT-qPCR 分析，在第3 組中篩選到LYG007706 在桂花花瓣衰老后期(S6)顯著上調表達，與ZOU 等[6]研究中乙烯釋放峰(脫落期)一致，推斷其可能參與乙烯途徑的桂花花瓣衰老調控。由此推斷，第3 組中與擬南芥AtACOs 聚類的10 個其他OfACOs 成員可能參與桂花其他組織部位的調控。

4 結論

本研究通過對桂花OfACOs 基因家族的鑒定與表達分析，篩選到4 個在開花后期顯著差異上調的成員：LYG006223、LYG007706、LYG007045 和LYG035696，它們可能參與桂花花瓣衰老的調控。其中，LYG006223 和LYG007045 都定位在3 號染色體上，且有著相同的保守基序；LYG007706 定位在4 號染色體上；LYG035696 定位于21 號染色體。后續(xù)將進一步驗證這4 個成員的功能，探索其參與桂花花瓣乙烯合成途徑及衰老的調控機制。