桂花OfABFs基因克隆和表達分析

洪方蕾，陸 瑤，俞世姣，胡芷諾，繆云鋒，鐘詩蔚，趙宏波

（1.浙江農林大學 浙江省園林植物種質創新與利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 南方園林植物種質創新與利用國家林業和草原局重點實驗室，浙江 杭州 311300；3.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

bZIP 轉錄因子家族是植物中最大、最保守且功能最多樣的基因家族之一，廣泛參與調節多種生物學過程[1-2]。ABF (ABRE binding factor)轉錄因子屬于bZIP 基因家族的A 亞族[3]，特異存在于植物中，ABFs 是ABA 信號轉導途徑的關鍵基因，能夠特異識別ABA 響應元件(ABA-responsive element，AREB)，并通過與AREB 結合參與下游響應ABA 信號靶基因的調控[4]。月季Rosachinensis中RhABF2 基因能夠與含有ABRE 元件的RhFer1 啟動子結合，共同調節鐵平衡參與調控花瓣衰老過程[5]；睡蓮NymphaeacoloratabZIP 家族A 亞組的11 個成員的啟動子區域有大量ABA 響應元件，在ABA 信號轉導中具有重要作用[6]；菊花Chrysanthemum×morifolium中鋅指蛋白BBX19 和ABF3 互作，通過誘導ABA 響應基因表達來調控菊花的耐旱性[7]。桂花Osmanthusfragrans屬于木犀科Oleaceae 木犀屬Osmanthus常綠喬木，是中國傳統十大名花之一。溫度、濕度是影響桂花花開放的重要因素。為了解ABFs 轉錄因子在桂花中的作用，本研究以秋桂品種‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhonggui’為材料，在桂花基因組中篩選出相關OfABFs 基因序列，通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析OfABFs 基因在‘堰虹桂’不同組織和花開放進程中的時空表達模式，為后續闡明ABFs 基因家族各成員的生物學功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江農林大學桂花資源圃的桂花品種‘堰虹桂’盆栽植物為材料，選取株齡相同、長勢一致的健康植株，分別于起始1 期(圓珠期前3 d，B1)，起始2 期(圓珠期前2 d，B2)，起始3 期(圓珠期前1 d，B3)，圓珠期(S1)，頂殼期(S2)，鈴梗期(S3)，初開期(S4)，盛開期(S5)，盛開末期(S6)，衰老期(S7)共10 個時期進行取樣(圖1)[8]。同樣，取桂花不同組織的樣品，包括根、新葉、新枝、老葉、老枝、盛開期的花朵，每個時期樣品采集3 份，液氮速凍后儲藏于-80 ℃冰箱。

圖1 桂花花開放各時期表型圖Figure 1 Phenotypic of O. fragrans in different periods

1.2 方法

1.2.1 桂花OfABFs 轉錄因子鑒定及簡單克隆 桂花核苷酸序列來源于桂花基因組數據庫[9]，從擬南芥Arabidopsisthaliana信息資源(TAIR) 數據庫(http://www.arabidopsis.org/) 和PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)數據庫中獲得擬南芥的ABFs 氨基酸序列，以此作為查詢對象，使用NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在桂花基因組蛋白數據庫中進行同源比對，確定桂花中的ABFs 基因序列。利用NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對OfABFs 進行保守功能域預測。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析OfABFs 蛋白結構域。

RNA 的提取使用RNA prep Pure Plant Plus Kit 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，使用核酸分析儀(賽默飛世爾科技公司)對RNA 的純度與濃度進行檢測，并用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。使用HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(南京諾維贊生物科技股份公司)，對花開放不同時期的cDNA 進行合成。

運用Primer 5.0 進行簡單克隆引物設計(表1)，以花開放時期的花芽cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 反應體系(20 μL)：上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、cDNA 模板1 μL、GreenTaqMix10 μL和ddH2O 7 μL。PCR 擴增程序：預變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，15 s，退火溫度以各自引物最佳溫度為準，15 s，延伸72 ℃，3 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min。將PCR 反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段回收純化后與pMD-18T 載體連接，連接產物轉化大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α 感受態細胞，PCR 初步鑒定陽性克隆后送杭州有康生物科技有限公司測序，經比對后確定序列。

表1 桂花OfABFs 簡單克隆引物Table 1 Primers for Cloning of OfABFs in O. fragrans

1.2.2 桂花OfABFs 基因染色體定位分析 利用TBtools[10]從桂花基因組Gff 文件中提取桂花OfABFs 基因的染色體位置信息，通過在線分析工具TBtools 進行繪圖可視化。

1.2.3 桂花OfABFs 轉錄因子結構分析 用DNAMAN 對已篩選的桂花OfABFs 轉錄因子進行氨基酸序列比對，分析其保守結構域和氨基酸序列同源性；通過在線分析軟件MEME 5.1.0 分析ABFs 的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme)，并用TBtools 對其進行繪圖和可視化。對桂花OfABFs 二級結構特征采用在線軟件SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)進行預測分析；使用在線網站Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)構建OfABFs 蛋白的三級結構模型。

1.2.4 桂花OfABFs 轉錄因子蛋白質理化性質分析及亞細胞定位預測 運用ExPASy 在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對OfABFs 進行蛋白質、分子量、理論電點、酸堿性等預測分析和編碼；利用SignalP 4.1 Server 分析桂花OfABFs 蛋白有無信號肽。亞細胞定位預測通過在線工具wolfpsort(https:// wolfpsort.hgc.jp/)完成。

1.2.5 桂花OfABFs 轉錄因子系統進化樹構建 從美國國家生物信息中心(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取擬南芥、煙草Nicotianatabacum、水稻Oryzasativa、大麥Hordeumvulgare、小麥Triticumaestivum、番茄Solanumlycopersicum、油橄欖Oleaeuropaea的ABFs 氨基酸序列，使用MEGA 11.0 軟件進行同源聚類，建立系統發育樹并選擇Bootstrap (1 000 次)評估檢測系統進化樹。

1.2.6 桂花OfABFs 轉錄因子的表達分析 利用Primer Premier 5.0 對5 個OfABFs基因進行熒光定量特異性引物設計(表2)，桂花OfACT作為內參基因[11]，以‘堰虹桂’不同組織及不同花開放時期的花芽cDNA 為模板進行RT-qPCR 擴增。反應體系為20 μL：cDNA 模板2 μL，2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR 程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環；然后以95 ℃持續15 s，60 ℃持續1 min，95 ℃持續15 s 作為熔解曲線分析程序。每個樣品設置3 次重復。

表2 桂花OfABFs 轉錄因子RT-qPCR 特異性引物Table 2 Specific primers for RT-qPCR of OfABFs in O. fragrans

2 結果與分析

2.1 桂花OfABFs 轉錄因子鑒定及克隆

通過對桂花基因組數據分析，得到5 條OfABFs基因序列，依次命名為OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4、OfABF6。用‘堰虹桂’花開放時期的花芽(混樣) cDNA 為模板進行PCR 擴增(圖2)。結果顯示：OfABFs的開放閱讀框(ORF) 長度為1 329～1 572 bp，編碼442～523 個氨基酸；其中基因OfABF4 氨基酸序列最長，編碼523 個氨基酸；基因OfABF6 的氨基酸序列最短，編碼442 個氨基酸。

圖2 桂花OfABFs 基因片段PCR 擴增Figure 2 PCR amplification of OfABFs of O. fragrans

2.2 桂花OfABFs 基因家族染色體定位分析

根據‘堰虹桂’基因組Gff 文件定位5 個OfABFs 基因。結果顯示：5 個桂花OfABFs 基因分布在5 條染色體上，且各個基因在染色體上分布的數量相等，1 號、6 號、11 號、12 號和22 號染色體上各分布1 個OfABF 基因(圖3)。

圖3 桂花OfABFs 基因家族染色體定位分析Figure 3 Chromosome location analysis of OfABFs genes in O.fragrans

2.3 桂花OfABFs 轉錄因子結構分析

利用SMART 在線分析軟件對桂花OfABFs 進行功能結構域預測。結果顯示：5 個桂花ABFs 均含有BRLZ 結構域(圖4)。BRLZ 結構域是bZIP 家族特有的保守域，由堿性區和亮氨酸拉鏈區組成，能夠識別特定的DNA 序列，以二聚體形式發揮功能[12]。通過DNAMAN 軟件，將OfABFs 氨基酸序列進行比對(圖5)。結果顯示：OfABF3 和OfABF4 同源性最高，OfABF1 和OfABF6 同源性最低；5 個C 端均含有能被激酶識別的保守序列RXXS/T。

圖4 桂花OfABFs 功能結構域分析Figure 4 Functional domains of OfABFs in O. fragrans

圖5 桂花OfABFs 轉錄因子氨基酸序列比對Figure 5 Sequence alignment of OfABFs transcription factor in O. fragrans

對桂花ABFs 氨基酸序列進行保守基序分析發現(圖6)：OfABFs 蛋白結構域中含有10 個蛋白基序(Motif 1～Motif 10)，其中Motif 7 在除OfABF4 外的4 個蛋白中均被鑒定到，Motif 8 在除OfABF6 外的4 個蛋白中均被鑒定到，其余8 個Motif 高度保守，是OfABFs 核心結構域的組成部分。

圖6 桂花OfABFs 蛋白質保守結構域Figure 6 Conserved motifs OfABFs proteins in O. fragrans

桂花OfABFs 蛋白的二級結構預測表明：桂花OfABFs 蛋白的二級結構均含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈、無規則卷曲，不同結構占比從大到小依次為無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-折疊。其中，β-折疊占比最小，均在5% 以下；延伸鏈占比為10%～13%；α-螺旋和無規則卷曲占二級結構總量的83%，為OfABFs 蛋白二級結構的主要構成元件(表3)。

表3 桂花OfABFs 蛋白二級結構分析Table 3 Secondary structure analysis of protein OfABFs in O. fragrans

桂花OfABFs 蛋白三級結構分析顯示(圖7)：OfABFs 蛋白三級結構均含豐富的α-螺旋和無規則卷曲，這與其二級結構預測結果一致。含無規則卷曲較多的蛋白穩定性要低于含α-螺旋、β-折疊多的蛋白，在OfABFs 蛋白中無規則卷曲比例均高于50%，為不穩定蛋白，這與其理化性質分析預測結果一致(表3)。

圖7 桂花OfABFs 蛋白三級結構預測Figure 7 Prediction of tertiary structure of the OfABFs protein in O.fragrans

2.4 桂花OfABFs 轉錄因子蛋白理化性質分析及亞細胞定位預測

對桂花ABFs 家族蛋白理化性質的分析結果表明：桂花氨基酸長度為450～523 個，相對分子質量為25.7～56.2 kDa，理論等電點為4.77～10.03，編碼氨基酸序列最長的的是OfABF4，其相對分子質量最大，為56.2 kDa；編碼氨基酸序列最短的是OfABF2，其相對分子質量也最小，為25.6 kDa。5 個OfABFs基因成員的不穩定系數為46.76～54.43。如果將不穩定系數＞40 的蛋白判斷為不穩定蛋白，那么5 個基因的蛋白不穩定系數均高于40，均為不穩定蛋白。桂花ABFs 蛋白脂溶性系數為65.29～78.07，親水性總平均系數為-0.659～-0.482，均小于0，為親水性蛋白。信號肽分析結果顯示：桂花ABFs 編碼蛋白均不含有信號肽，表明桂花ABFs 家族蛋白均非分泌蛋白。亞細胞定位預測發現(表4)：5 個編碼蛋白均定位在細胞核，這與其作為轉錄因子的生物學功能相吻合。

表4 桂花OfABFs 蛋白理化性質分析Table 4 Physicochemical properties of OfABFs proteins of O. fragrans

2.5 桂花OfABFs 轉錄因子多序列比對和進化分析

構建系統進化樹進一步研究OfABFs 的進化關系，結果表明(圖8)：8 個物種的25 條氨基酸序列可分為5 個分支(分支Ⅰ～Ⅴ)，其中OfABFs 分布在2 個分支中。OfABF1、OfABF3 和OfABF4 均分布在分支Ⅰ，該分支包括油橄欖OeTRAB1、煙草NtABF2、馬鈴薯SolanumtuberosumStABF、馬鈴薯StABF1、番茄SlAREB1 和擬南芥AtABF2，說明OfABF1、OfABF3 和OfABF4 在進化過程中與這些物種親緣關系較近；OfABF2 和OfABF6 與番茄SlABF4 聚為分支Ⅱ。

圖8 桂花OfABFs 與各物種ABFs 轉錄因子進化分析Figure 8 Studies on the relationship between O. fragrans OfABFs and the evolution of ABFs transcription factors in different species

2.6 桂花OfABFs 轉錄因子在不同組織和花開放時期的表達分析

利用熒光定量分析5 個基因在根、嫩枝、老枝、新葉、老葉等不同組織中的表達情況。定量結果(圖9)顯示：OfABF1 在花中表達量最高，在老葉和新葉中表達沒有顯著差異，在新枝和老枝中相對表達量最低；OfABF2 在老葉中表達最高，其次為新葉，在花中表達略高于枝；OfABF3 在葉中表達水平相對其他組織高，在花和枝中表達較低。OfABF4 在花中相對表達量最高，其次是新葉和老葉，老枝中表達量最低，OfABF6 的相對表達量在花中最高，在其他組織中的表達量均較低。OfABF1、OfABF4、OfABF6 在所有組織中均有表達，但在花中的相對表達水平最高，尤其是OfABF6。

圖9 5 個OfABFs 基因在不同組織的表達結果Figure 9 Expression results of 5 OfABFs genes in different tissues

由圖10可見：起始1 期(B1)到起始3 期(B3)花芽芽體肥大并延伸。圓珠期(S1)到盛開末期(S6)為花開放時期，OfABF1 在頂殼期(S2)被轉錄激活，表達顯著升高，鈴梗期(S3)后表達水平雖呈下降趨勢，但仍保持較高水平；OfABF2 在起始1 期(B1)到圓珠期(S1)時期幾乎不表達，在頂殼期(S2)的表達量到達峰值，且相對表達水平顯著高于其他時期；OfABF3 和OfABF4 在花朵衰老期(S7)的相對表達量最高，在盛開末期(S6)的表達量其次，圓珠期(S1)至盛開期(S5)表達趨勢變化不顯著；OfABF6 的相對表達量在花朵衰老期(S7)最高。由此說明：OfABF1 和OfABF2 可能與桂花花開放進程有關，OfABF3、OfABF4 和OfABF6 可能參與桂花花衰老的調控。

圖10 5 個OfABFs 基因在花開放時期的表達結果Figure 10 Express an results of 5 OfABFs genes in different flower opening periods

3 討論

ABF 轉錄因子在模式植物擬南芥、煙草以及園藝作物中的研究較多。ABFs 已在擬南芥、煙草、楊樹Populus中被鑒定[12-15]。LI 等[16]對29 種陸地植物中的95 種ABFs 蛋白長度、分子量進行分析，發現ABF 的氨基酸長度為254～485 個；分子量為27.81～52.95 kDa。目前，關于桂花OfABFs的研究較少，通過鑒定與分析桂花OfABF 轉錄因子，可進一步了解桂花OfABFs 的生物學功能及其表達分析。

OfABFs 蛋白的二級結構組成與煙草、睡蓮、野菊Chrysanthemumindicum、藍莓Vacciniumcorymbosum、大豆Glycinemax[6,17-20]等其他物種中的結構相類似，均以α-螺旋和無規則卷曲為主要構成元件，少量β-折疊和延伸鏈散布于整個多肽鏈中。說明在基因變異和進化時，雖然基因外顯子的數量上發生變化，但仍具有其保守性，這與楊穎等[2]的研究結果基本一致。基于蛋白行使特定功能依賴其三維結構，本研究使用蛋白三級結構預測軟件SWISS-MODEL 同源模擬桂花OfABFs 蛋白三級結構，結果顯示：OfABF2 與煙草[17]中的同源蛋白質NtABF1、NtABF2 三級結構類似，除OfABF2 蛋白外，其余成員蛋白三級結構在空間結構上相似度較高，進一步說明ABF 蛋白在進化上較保守，具有對植物生長發育的重要功能。序列比對結果顯示：5 個OfABFs 的C 端均具有bZIP 轉錄因子特有的BRLZ 結構域，且含有保守序列RXXS/T，推測OfABFs 轉錄因子可通過被磷酸化激活，從而結合下游基因啟動子區域的ABRE 元件，調控相關下游脅迫響應基因[20-21]。

系統發育結果顯示：桂花ABFs 基因家族成員全部分布在以雙子葉植物油橄欖、番茄、馬鈴薯、煙草為主的分支Ⅰ和分支Ⅱ中，無家族成員分布在以單子葉植物小麥、大麥、水稻等為主的分支Ⅲ、分支Ⅳ和分支Ⅴ中。由此推測，桂花ABFs 與雙子葉植物親緣關系較近，與單子葉植物的親緣關系較遠。表明在進化過程中，ABF 在種屬間是高度保守的。

根據親緣關系推測桂花OfABFs 基因功能，如在分支Ⅰ中，OfABF1、OfABF3、OfABF4 與馬鈴薯StABF、番茄SlAREB1、煙草NtABF2、擬南芥AtAREB1 親緣性較高。在對環境的脅迫應答過程中，番茄SlAREB1 的過表達可增加物種干旱和鹽脅迫耐受性[22]，誘導有機酸積累的變化并參與其合成的基因編碼酶的表達[23]；煙草NtABF2 與擬南芥AtAREB1 響應非生物脅迫，前者通過與脅迫響應基因啟動子區的ABRE 元件結合相關基因的轉錄[16,23-24]，后者受ABA 含量等滲透脅迫誘導，作為關鍵基因參與ABA 信號調控通路以增強物種抗旱性[25]，顯著提高ABA 依賴性逆境響應基因的表達水平[25-28]；在分支Ⅱ中，OfABF2、OfABF6 與番茄SlABF4 同源性較高，且SlABF4 作為ABA 響應因子，ABA 通過其對SICOL4 產生負調控作用，使其與下游乙烯通路相關的基因互作[29]，調控乙烯的合成和信號轉導進而調控番茄果實的成熟進程[29-30]。由此推測：桂花OfABFs 可以作為ABA 響應因子，參與ABA 信號轉導，影響植物整個生長發育過程[31]。牡丹Paeoniasuffruticosa切花保鮮的研究發現：ABA 以誘導乙烯大量合成的方式間接加速牡丹切花的衰老[32]。還有研究發現：在月季花瓣衰老過程中內源ABA 含量迅速上升，促進RhABF2 的表達量上調，從而推測RhABF2 在月季花瓣衰老過程中發揮調節作用[7]。在桂花中OfABF3、OfABF4 和OfABF5 的相對表達量在衰老期急劇上升，推測在桂花花瓣衰老過程中內源ABA 含量上升，OfABF3、OfABF4 和OfABF5 可能參與調節桂花花瓣的衰老。推測OfABFs 基因響應內源ABA，參與桂花衰老的可能性較大。5 個OfABFs 基因在桂花中的功能值得進一步探討。

4 結論

以桂花品種‘堰虹桂’為材料，在基因組數據庫中篩選出相關5 條OfABFs基因序列。生物信息學分析得出：桂花ABFs 蛋白具有親水性，較不穩定，無信號肽段。其蛋白二、三級結構預測具有相似特性，無規則卷曲和α-螺旋為其結構組成的主要元件；5 條OfABFs基因序列均含有bZIP 轉錄因子家族保守結構域；亞細胞定位預測表明：5 條OfABFs 編碼蛋白均定位在細胞核。熒光定量PCR 結果表明：OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4 和OfABF6 在桂花中的表達具有組織特異性，其中OfABF1、OfABF4 和OfABF6 在花中表達較高。OfABF1 在頂殼期(S2)被轉錄激活，表達顯著升高，鈴梗期(S3)后表達水平雖呈下降趨勢，但仍保持較高水平；OfABF2 在頂殼期(S2)表達量達到峰值，且相對表達水平著顯高于其他時期；OfABF3、OfABF4 和OfABF6 在花朵衰老期(S7)的相對表達量最高。推測OfABF1、OfABF2 可能與桂花花開放進程有關，而OfABF3、OfABF4 和OfABF6 響應ABA 參與調控花朵衰老的可能性較大。