‘潢川金桂’花瓣衰老過程中細(xì)胞程序性死亡的生理機(jī)制

賀 貝，蔡 璇，曾祥玲，王彩云，周 媛，鄒晶晶

（1.湖北科技學(xué)院 國家林業(yè)草原桂花工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林業(yè)果樹研究所，湖北 武漢 430070）

桂花Osmanthusfragrans為木犀科Oleaceae 園林觀賞植物，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，自古享有“獨占三秋壓眾芳”的美譽(yù)。其樹姿優(yōu)美，在園林中常用作行道樹、孤植樹；因香氣濃郁，被列為中國重要的天然保健植物和特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)香花植物，廣泛用于食品添加劑及護(hù)膚品等產(chǎn)業(yè)。關(guān)于桂花茶、桂花(米)酒、桂花糕等鮮花采收加工產(chǎn)業(yè)已成熟，近年來新興的桂花香水、乳液、香熏和精油等高檔化妝品也逐漸打開市場[1-3]。然而，由于桂花花期較短，最佳觀賞期和采收期僅2～3 d，極大地限制了其觀賞價值與經(jīng)濟(jì)價值[4-5]。在目前記載的160 多個桂花品種中，大部分由于雌蕊敗育不結(jié)實，表現(xiàn)為開花后期脫落型；另一類為結(jié)實型桂花品種，開花后期花瓣表現(xiàn)為萎蔫，在樹體不脫落[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)：在不結(jié)實桂花品種‘柳葉金桂’O.fragrans‘Liuye Jingui’的衰老過程中，當(dāng)脫落期花瓣出現(xiàn)明顯可見的衰老特征時，花瓣中DNA 斷裂迅速增加，衰老后期花瓣中出現(xiàn)染色質(zhì)凝結(jié)等典型的細(xì)胞程序性死亡(PCD)現(xiàn)象[4,7]。然而，對于結(jié)實型桂花衰老過程中的PCD 特征還不清楚。因此，本研究以結(jié)實型桂花品種‘潢川金桂’O.fragrans‘Huangchuan Jingui’為試材，探索結(jié)實型桂花花瓣衰老過程中PCD 特征，為桂花花瓣衰老機(jī)制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選取華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)40～50年生、健康、無病蟲害、四周光照均勻的‘潢川金桂’植株，分別采收不同開花階段的桂花花朵，收集花瓣后稱量，保存在冰盒或者液氮中，立即帶回實驗室，進(jìn)行指標(biāo)的檢測并存至-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 開花級數(shù)的劃分 參考ZOU 等[4]桂花開花級數(shù)的劃分體系，將 ‘潢川金桂’開花級數(shù)劃分為：①鈴梗期(花苞期)，花朵呈緊閉的花苞狀，未展開；②初花期，花朵微張，呈半開放狀態(tài)；③盛花期，花瓣完全展開，柱頭產(chǎn)生黃色黏性物時進(jìn)行授粉，花徑達(dá)到最大；④盛花末期，花瓣略微開始失水，有的花瓣伴隨褐斑出現(xiàn)；⑤萎蔫期，花朵失水萎焉并留在樹體上，花瓣呈黃褐色，子房略膨大。

1.2.2 超氧陰離子(ROS) 和過氧化氫測定 參考ZOU 等[4]的方法測定ROS 質(zhì)量摩爾濃度(nmol·g-1)，參考林植芳等[8]的方法測定過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度(nmol·g-1)。稱取新鮮花瓣組織0.2 g，按材料與提取液1∶1 的質(zhì)量比加入4 ℃下預(yù)冷丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管10 000 r·min-1離心10 min，棄去殘渣，上清液即為樣品提取液。用Ti2(SO4)-濃氨水法制作過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線，取樣品提取液1 mL 用于反應(yīng)測定。

1.2.3 細(xì)胞色素c 和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)測定 參考ZOU 等[5]的方法，以小鼠細(xì)胞色素c 單克隆抗體(Merck & Co.,Inc)作為一抗(1∶200 稀釋)，用封閉液按1∶50 000 稀釋相應(yīng)的HRP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗。參照ZOU 等[5]的方法，采用高效液相色譜法檢測ATP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ng·g-1)。

1.2.4 乙烯釋放量測定 參考ZOU 等[4]的方法測定桂花乙烯釋放量(nL·g-1)。

1.2.5 DNA 相對含量測定 參考YAMADA 等[9]的方法，采用流式細(xì)胞法測定不同衰老時期桂花花瓣中核含量(DNA 團(tuán)塊)的變化。將桂花花瓣置于細(xì)胞核提取緩沖液中，將提取物通過50 μm 尼龍網(wǎng)過濾，收集分離介質(zhì)和DNA 凝聚物，DAPI 染色后，將溶液旋渦混合，用流式細(xì)胞儀分析從細(xì)胞核中分離出的DNA，計算并分析5 000 個樣品細(xì)胞中所含有核的DNA 相對含量。流式細(xì)胞儀的儀器型號為BECKMAN COULTER (Cell Lab QuantaTM)，儀器條件為：Ev 2.36；FL1 5.12、5.9；SS 5.12；5 000 個細(xì)胞。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每處理3 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。用SAS v.8.0.軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析(Duncan,P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超氧陰離子和過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度的變化

在‘潢川金桂’桂花開花至衰老過程中，超氧陰離子質(zhì)量摩爾濃度在初花期顯著上升到最大值，為344.6 nmol·g-1，其后逐漸降低至200 nmol·g-1(圖1A)。在‘潢川金桂’初花期花朵剛開放時，過氧化氫的質(zhì)量摩爾濃度也顯著地迅速上升到最大值，為437 nmol·g-1，此時過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度是花苞期的3 倍。在隨后衰老過程中，過氧化氫又下降到花苞期的水平(圖1B)。

圖1 ‘潢川金桂’開放及衰老過程中超氧陰離子(A)和過氧化氫(B)質(zhì)量摩爾濃度的變化Figure 1 Changes in content of free radicals (O2· -,A) and hydrogen peroxide (H2O2,B) in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.2 細(xì)胞色素c 的釋放

如圖2所示：從線粒體釋放細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c 在初花和盛花期變得明顯，表明此時已經(jīng)發(fā)生了線粒體細(xì)胞色素c 的泄漏；在盛花末期開始逐漸減弱，在萎蔫期的花瓣中則逐漸消失，可能與此時花瓣衰老細(xì)胞膜功能逐漸喪失有關(guān)。

圖2 ‘潢川金桂’開放及衰老過程中細(xì)胞色素c 的釋放Figure 2 Release of cytochrome c during the petals senescence of O.fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.3 ATP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

如圖3所示：在‘潢川金桂’的鈴梗期花瓣中測量到較高的ATP 水平(63.9 ng·g-1)，但隨著花朵的開放至萎蔫期時，‘潢川金桂’花瓣中的ATP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.8 ng·g-1，只有花苞期的一半。由此可見，在桂花花瓣衰老過程中ATP 消耗或缺乏可能是PCD 發(fā)生的早期信號。

圖3 ‘潢川金桂’開放及衰老過程中ATP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 3 ATP content in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.4 乙烯釋放量的變化

在‘潢川金桂’開放及衰老過程中，乙烯釋放量從盛花期開始逐漸上升；盛花末期花瓣出現(xiàn)可見的外觀衰老特征時，其釋放量顯著增加到35.9 nL·g-1·h-1，而在萎蔫期時上升至最大值，為91.2 nL·g-1·h-1(圖4)，因此乙烯釋放類型表現(xiàn)為典型的末期上升型，其釋放量的增加可能與花瓣晚期PCD 事件的發(fā)生相關(guān)。

圖4 ‘潢川金桂’開放及衰老過程中乙烯釋放Figure 4 Ethylene production in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.5 核DNA 相對含量的變化

如圖5所示：DNA 相對含量在開花早期相對穩(wěn)定，而隨著花瓣衰老進(jìn)程的發(fā)展，核DNA 相對含量逐漸降解，直到萎蔫期花瓣的核DNA 基本消失，暗示著核DNA 完全降解。

圖5 ‘潢川金桂’開放及衰老過程中核DNA 相對含量的變化Figure 5 DNA content the petals senescence of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

3 討論

花瓣衰老標(biāo)志著花朵生命的最后階段，是發(fā)育相關(guān)的PCD[9]。PCD 的誘發(fā)和執(zhí)行過程都常常伴隨一系列典型的生理、生化、形態(tài)學(xué)上的變化以及特征事件[10-11]。在動物細(xì)胞PCD 進(jìn)程中，ROS 可以作為信號分子激活線粒體上非特異性的通透性孔道(PTP)開放[11-17]，從而造成線粒體中細(xì)胞色素c 和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF) 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而后細(xì)胞色素c 與凋亡酶激活因子(Apaf-1) 結(jié)合，從而促使細(xì)胞發(fā)生PCD[10]。在本研究中,‘潢川金桂’活性氧含量在初花期急劇增加，可能是桂花花瓣P(guān)CD 早期誘導(dǎo)因子。作為線粒體中電子傳遞鏈的重要組成成分，細(xì)胞色素c 泄露會導(dǎo)致電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁€粒體功能活性下降，從而導(dǎo)致ATP 減少[18]，最終加快花瓣衰老。在‘潢川金桂’花瓣衰老過程中，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c 逐漸積累，至盛花期達(dá)到最大，ATP 水平從初花期開始持續(xù)下降，說明此時線粒體功能活性已逐漸喪失。在郁金香花瓣中，能量損耗也被認(rèn)為是誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡的早期信號[15]。

有些不結(jié)實的桂花栽培品種，盛花后2～3 d，在花瓣仍然具有膨壓時便脫落[5-6]；而在大多結(jié)實的桂花栽培種中，通常以花瓣萎蔫為衰老特征。乙烯是一種促進(jìn)成熟與衰老的激素，也是導(dǎo)致花瓣發(fā)生細(xì)胞程序性死亡的因素之一，在促進(jìn)DNA 片段化、導(dǎo)致花瓣脫落和枯萎等方面發(fā)揮著作用[12]。研究表明：大多數(shù)植物的花瓣脫落都對乙烯敏感，且受到內(nèi)源乙烯的調(diào)控[19-20]。在‘柳葉金桂’衰老過程中，乙烯的增加導(dǎo)致花瓣細(xì)胞中液泡結(jié)構(gòu)損壞，在外觀上表現(xiàn)為花瓣褐化和失水萎蔫[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)：花瓣明顯可見的萎蔫常常伴隨著乙烯峰驟變，該乙烯驟變多又與授粉結(jié)實有關(guān)[21-23]。在本研究中，當(dāng)結(jié)實型桂花品種‘潢川金桂’萎蔫期花瓣內(nèi)乙烯釋放量增加到最大值時，對應(yīng)的外觀形態(tài)上表現(xiàn)出枯萎、褐化，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生核DNA 的降解等現(xiàn)象，說明乙烯可能是導(dǎo)致結(jié)實型桂花花瓣衰老的主要執(zhí)行因子。在月季Rosa×hybrida花瓣程序性死亡的研究中發(fā)現(xiàn)：施用外源乙烯可以誘導(dǎo)ACC基因的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源乙烯的生物合成，從而加速PCD 進(jìn)程[24]。

DNA 斷裂和降解作為PCD 發(fā)生的標(biāo)志性特征之一[25]，常表現(xiàn)出經(jīng)典的“DNA ladders”，如唐菖蒲Gladiolus、六出花Alstroemeria和飛燕草Delphiniumbelladonna[9,26-27]；而有些植物衰老過程中并沒有出現(xiàn)“DNA ladders”，如矮牽牛Petunia[28-29]。在‘柳葉金桂’的花瓣衰老過程中也未檢測到“DNA ladders”，但通過原位末端標(biāo)記法(TUNEL)發(fā)現(xiàn)：其花瓣在盛花末期開始發(fā)生明顯的DNA 斷裂和降解；且其DNA 降解受內(nèi)源乙烯調(diào)控[4,7]。在本研究中，花瓣衰老后期乙烯的驟變與后期DNA 相對含量的下降，說明乙烯可能促進(jìn)了“潢川金桂”花瓣DNA 的降解，在矮牽牛[30]和豌豆Pisumsativum[31]中也有類似報道。

4 結(jié)論

本研究探索了結(jié)實桂花品種‘潢川金桂’衰老的PCD 特征，表明ROS 激發(fā)、細(xì)胞色素c 釋放和ATP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降是早期PCD 誘導(dǎo)因子；乙烯躍變可能作為晚期作用因子促進(jìn)花瓣細(xì)胞的失水、萎蔫和DNA 降解。