代謝物組學和細胞因子譜學探討顱內動脈瘤破裂的危險因素研究

劉清源，姜朋軍，王碩，吳俊

顱內動脈瘤破裂是導致蛛網膜下腔出血的主要因素[1]，判斷動脈瘤是否具有較高的破裂風險，對于制訂未破裂顱內動脈瘤（unruptured intracranial aneurysm，UIA）的治療策略有重要意義。炎癥和顱內動脈瘤破裂密切相關[2-3]，既往文獻顯示，相比于UIA，破裂顱內動脈瘤（ruptured intracranial aneurysm，RIA）的瘤壁存在大量炎癥細胞浸潤和基質降解的特點[4]。進一步研究表明，炎癥相關因素（如瘤壁增強和炎癥相關蛋白）可以用來區分RIA和UIA，并有可能作為預測顱內動脈瘤生長破裂風險的指標[5]。

代謝物和細胞因子是可以影響血管壁的微環境[6]。細胞因子主要包括促炎因子、抑炎因子和趨化因子等，參與免疫反應和細胞焦亡等病理生理過程。既往文獻顯示，IL-1β等細胞因子在動脈粥樣硬化和腦梗死等疾病的發展過程中起到了重要的作用[7-10]，同時也發現，代謝物參與了腦梗死、心力衰竭、腹主動脈瘤破裂等心腦血管疾病。由此可見，深入探討顱內動脈瘤患者代謝組學和細胞因子譜學特點，有助于發掘和顱內動脈瘤破裂有關的生物學標志物。

本前瞻性研究收集了單發顱內動脈瘤行手術治療患者的動脈瘤組織和血清樣本，利用代謝組學和細胞因子譜學的方法分析代謝物和細胞因子，并探討與顱內動脈瘤破裂有關的生物學標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究收集了2020年1月—2022年1月因單發顱內動脈瘤在首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科行手術治療的患者。根據患者入院時顱內動脈瘤是否破裂，將患者分為RIA組和UIA組。本研究已經通過倫理委員會批準（倫理批號：KY2017-076-01）。

納入標準：①年齡18～75歲；②經CTA或者DSA證實顱內單發囊性動脈瘤[11]；③動脈瘤經過開顱夾閉治療，并能獲得動脈瘤的組織樣本；④患者同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他腦血管畸形（如腦動靜脈畸形和海綿狀血管瘤）和腦腫瘤（如腦膜瘤、膠質瘤或者垂體瘤）；②動脈瘤為夾層性或者血栓性；③動脈瘤為創傷性或者心房黏液瘤性；④動脈瘤家族病史；⑤多囊腎、結締組織疾病或者風濕免疫性疾病；⑥既往接受過動脈瘤相關的手術治療，或為復發顱內動脈瘤。

1.2 資料收集 收集患者的年齡、性別、合并疾病情況（原發性高血壓、血脂異常、糖尿病、TIA或腦梗死、冠心病）、吸煙史（未戒煙或戒煙時間＜1年）、飲酒史（每周喝酒至少1次）和用藥史（阿司匹林和他汀類服用情況）。

基于患者術前的CTA和DSA，本研究采用MIMICS軟件（17.0版，Mimics Research公司，比利時）對動脈瘤進行三維重建，并進一步分析以下指標：動脈瘤位置（大腦前動脈或前交通動脈、頸內動脈、大腦中動脈和后循環）、動脈瘤大小（從瘤頸平面中心到動脈瘤頂的最遠距離）、動脈瘤形態是否規則（動脈瘤是否有子瘤或動脈瘤呈分葉狀）。

1.3 樣本收集及代謝組學和細胞因子檢測 基于動脈瘤組織樣本和患者的血清樣本，進行代謝組學和細胞因子譜學分析。術中夾閉動脈瘤，切取動脈瘤頂部分組織，生理鹽水清洗可見的血塊，吸水紙干燥樣本，樣本保存于液氮中。進行代謝組學和細胞因子譜學分析前，將合適大小的動脈瘤組織研磨成粉，用細胞組織快速裂解液溶解組織粉末，在4 ℃條件下裂解20 min，1000轉/分鐘4 ℃離心20 min，收集上清液進行下一步檢測。

所有患者均在行術前準備后（空腹8 h后）、麻醉前采集靜脈血樣。血樣采集后3 h內，1000轉/分鐘 4 ℃離心10 min，收集血清并儲存在液氮中。基于動脈瘤組織和患者血清樣本，非靶向代謝組學的檢測方法采用液相色譜質譜連用法，在Q-TOF質譜平臺（Triple TOF 5600TM，Thermo公司，美國）上完成。基于動脈瘤組織和患者血清樣本，靶向代謝組的檢測采用質譜多反應監測法，在TRAP質譜平臺（API 6500Q，AB SCIEX，美國）上完成。細胞因子檢測在Bio-Plex MAGPIX平臺（Bio-Rad公司，美國）上進行，運用Luminax抗體預孵育芯片（Bio-Rad公司，美國）檢測46個細胞因子。計算RIA和UIA的代謝物和細胞因子表達水平的平均值，最后計算倍數值（fold change，FC），公式為其中RIA和UIA之間，具備|log1.5FC|＞1且P＜0.05的代謝物和細胞因子，為具有統計學差異的分子。進一步用ROC檢驗動脈瘤組織中和血清中的代謝物和細胞因子表達水平是否能區分RIA和UIA，結果用AUC表示。AUC＞0.7被認為參數能較好地區分RIA和UIA。如果代謝物和細胞因子的表達水平在組織和血清中存在相關性，且能較好地區分RIA和UIA，則被認為是顱內動脈瘤破裂的潛在生物標志物。

1.4 統計學方法 運用SPSS 20.0進行統計學分析。計數資料用例（%）表示，組間比較采用采用χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗或非參數檢驗。符合正態分布的計量資料用表示，不符合正態分布的計量資料用M（P25～P75）表示，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。Spearman相關性檢驗分析代謝物和細胞因子在組織和血清中表達水平的相關性。以顱內動脈瘤破裂為因變量，將單因素分析中P＜0.05且受試者曲線分析中AUC＞0.7的參數作為自變量進行多因素logistic回歸分析，從中篩選和顱內動脈瘤破裂相關的獨立相關因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RIA組和UIA組臨床特點比較 本研究共納入25例RIA患者和31例UIA患者，其中33例為男性，納入患者的平均年齡為（55±10）歲。17例（30.4%）動脈瘤的大小＜7 mm，30例（53.6%）動脈瘤的大小為7～10 mm，9例（16.0%）動脈瘤的大小＞10 mm。對比RIA組和UIA組間的患者臨床、動脈瘤影像學特點，年齡、性別、原發性高血壓、血脂異常、糖尿病、TIA或者腦梗死、冠心病、吸煙史、飲酒史、阿司匹林和他汀類藥物服用情況、動脈瘤位置、動脈瘤大小和動脈瘤形態不規則等資料差異無統計學意義（表1）。

表1 RIA和UIA組基線資料對比

2.2 RIA組和UIA組間的動脈瘤組織代謝物和細胞因子差異 主要成分分析顯示，RIA和UIA之間的代謝組學和細胞因子譜學特征存在分群差異（圖1A）。進一步行聚類分析發現，代謝物和細胞因子在RIA和UIA之間具有明顯的聚類特點（圖1B）。對比RIA和UIA之間的代謝組學和細胞因子譜學特征的差異，發現43個代謝物和5個細胞因子（FC的絕對值＞1，且P＜0.05）在RIA和UIA之間存在統計學差異（圖1C～D）。

圖1 RIA和UIA組間的代謝組學和細胞因子譜學差異

2.3 RIA組和UIA組的血清代謝物和細胞因子差異 進一步行代謝物的分類富集分析顯示，RIA和UIA組織之間的差異代謝物主要是脂質、脂質類似物和脂肪酰基類物質（圖2A）。通路富集分析發現這些差異代謝物主要參與不飽和脂肪酸的合成，而富集于該通路的3個代謝物（油酸、花生四烯酸和α-亞麻酸）也屬于脂質、脂質類似物和脂肪酰基類物質（圖2 B）。在R I A 和U I A 組織之間的差異細胞因子中，I L-1β、單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、I L-6 和TNF-α 為促炎因子，而I L-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，I L-1ra）為抗炎因子（圖2C）。本研究進一步分析了患者血清中代謝物和細胞因子的表達情況（圖2D、表2）。其中油酸、花生四烯酸、IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1ra在RIA和UIA患者之間存在統計學差異（均P＜0.05），而α-亞麻酸未見統計學差異（P=0.108）。

圖2 脂質相關分子和炎癥相關細胞因子與RIA相關

表2 RIA和UIA組血清代謝物和細胞因子水平比較

2.4 組織和血清中代謝物和細胞因子表達水平的相關性 油酸（r2=0.554，P＜0.001）、花生四烯酸（r2=0.527，P＜0.001）、IL-1β（r2=0.592，P＜0.001）、IL-1ra（r2=0.160，P＜0.001）和TNF-α（r2=0.246，P＜0.001）的表達水平有正相關性（圖3A）；而α-亞麻酸、IL-6、MCP-1的表達量在組織和血清之間不具有相關性（均P＞0.05）。進一步的ROC分析顯示，不論是組織中還是血清中的油酸、花生四烯酸和IL-1β的表達水平，均能很好地區分RIA和UIA（均AUC＞0.7，圖3B）。結合動脈瘤組織中和血清中油酸、花生四烯酸和IL-1β在RIA和UIA之間存在差異這一事實，可見這些分子是RIA的潛在生物學標志物。

圖3 脂質相關分子和炎癥相關細胞因子在動脈瘤組織和血清中的表達量存在相關性

2.5 顱內動脈瘤破裂的相關危險因素 動脈瘤組織和血清分析顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β在RIA和UIA之間的表達水平存在統計學差異。且組織中和血清中油酸、花生四烯酸和IL-1β的表達水平存在正相關性。同時ROC顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β能較好地區分RIA和UIA。因此油酸、花生四烯酸和IL-1β是能較好區分RIA和UIA的生物學標志物。基于這3個生物標志物，進一步行單因素logistic回歸分析，結果顯示低血清油酸水平（OR0.74，95%CI0.64～0.85，P＜0.001）、高血清油酸水平（OR1.03，95%CI1.01～1.05，P=0.006）和高血清IL-1β水平（OR1.02，95%CI1.00～1.03，P=0.010）是動脈瘤表現為RIA的危險因素。進一步行多因素logistic回歸分析，結果顯示低血清油酸水平是動脈瘤表現為RIA的獨立危險因素（表3）。

表3 顱內動脈瘤破裂獨立相關因素的多因素分析結果

3 討論

代謝物和細胞因子和腦血管病代謝密切相關。本研究通過分析56例顱內動脈瘤組織樣本和血清樣本的代謝組學和細胞因子譜學特點，發現RIA具有脂質代謝異常和炎癥相關細胞因子分泌異常的特點。油酸、花生四烯酸和IL-1β在動脈瘤組織和血清中的表達水平具有相關性，且ROC顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β較好地區分RIA和UIA。因此，油酸、花生四烯酸和IL-1β可能是評估顱內動脈瘤破裂風險的潛在生物學標志物。

代謝物參與了諸多心腦血管疾病的發生發展，并可以導致血管炎癥和血管粥樣硬化的發生[12]。而伴有炎癥和粥樣硬化的動脈瘤壁重構是RIA的重要病理生理學特點[13]。本研究通過代謝組學分析，發現RIA中存在脂質代謝異常的特點。同時，相比于UIA，在RIA組織和血清中，存在油酸表達量降低，而花生四烯酸表達量升高的現象。既往研究顯示，脂質代謝異常和粥樣硬化發生密切相關[14-15]。花生四烯酸可以作為環氧化酶1的底物，促進血管壁的炎癥[16]。油酸可以作為粥樣硬化抑制因子，促進平滑肌細胞的增殖，抑制血管炎癥的發生[17]。因此，在進一步的臨床試驗中，可以考慮將油酸和花生四烯酸納入評估顱內動脈瘤破裂風險的生物學標志物。

IL-1β可以被免疫細胞釋放進入循環系統或者組織間隙中，通過IL-1受體作用誘導細胞的焦亡反應[7，18]。而焦亡反應會進一步誘發局部的炎癥細胞聚集，從而導致組織的炎癥浸潤。既往研究中發現，IL-1β水平和血管的粥樣硬化密切相關[8]。而大面積的粥樣硬化導致的血管壁重塑同樣也是R IA的重要病理特點[13]。既往動物實驗也發現，抑制小鼠全身的IL-1β水平后，可以降低顱內動脈瘤破裂風險[19]。顱內動脈瘤的生長破裂是損傷和修復失衡的結果[20]。本研究中還發現IL-1ra在高風險顱內動脈瘤患者中顯著降低。IL-1β可以促進炎癥，而IL-1ra可以通過結合IL-1受體從而起到抑制IL-1β生物學作用的效果[21]。因此，IL-1β升高而IL-1ra降低的現象，提示RIA中存在炎癥調節失衡的現象。可見，血清IL-1β水平可能作為評估顱內動脈瘤破裂風險的生物學標志物，結合血清IL-1β和IL-1ra的情況可反映患者全身炎癥的平衡狀態。本研究還發現血清中MCP-1、TNF-α和IL-1ra的表達水平在RIA和UIA患者之間存在差異。但進一步分析顯示，MCP-1在動脈瘤組織和血清中的表達水平不存在相關性，同時MCP-1、TNF-α和IL-1ra在動脈瘤組織中的表達水平不能較好的區分RIA和UIA。這可能是由于MCP-1、TNF-α和IL-1ra的表達水平還受到其他合并疾病影響，且與顱內動脈瘤的相關性較弱有關。

本研究存在局限性。第一，本研究雖然對血樣采集和檢測進行了質量控制，但可能存在其他因素對代謝物和細胞因子水平產生影響。第二，本研究為斷面研究，不能很好地反映動脈瘤的自然破裂風險。第三，多因素logistic回歸分析只顯示油酸為動脈瘤破裂的獨立危險因素，這可能是本研究為單中心的小樣本研究所致。第四，由于考慮到破裂狀態會對血清細胞因子水平產生影響[22]，導致本研究存在患者選擇偏移。盡管存在以上局限性，本研究探討了RIA的代謝組學和細胞因子譜學特點，為探討顱內動脈瘤破裂的生物學標志物提供了基礎。

【點睛】本研究基于顱內動脈瘤的組織和相應的血清樣本，運用多組學的分析方法，發現油酸、花生四烯酸和IL-1β是評估顱內動脈瘤破裂風險的潛在生物學標志物。本研究為探討顱內動脈瘤破裂的生物學標志物提供了基礎。