不同光強對柔毛淫羊藿生長特性和淫羊藿酮醇苷含量的影響△

馬文青，徐超群，郭寶林*，張麗娟

1.天津中醫藥大學，天津 301617；

2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai 的干燥葉，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，在抗炎、抗氧化、抗骨質疏松等方面療效顯著[1]。淫羊藿藥材的市場需求日益增加，其中本課題組培育的柔毛淫羊藿品種——“貴同柔毛1 號”[2]種植推廣數量最大。該品種具有淫羊藿黃酮醇苷類成分含量高和根狀莖芽萌發能力強（從而產量較高）等特性，在生產中1 年采收2 次（第1次在6月、第2次在12月），采收期的藥材（淫羊藿葉）一般為萌發后生長40～90 d。淫羊藿屬所有品種均為陰生植物，喜半陰濕潤環境，對光環境敏感，光合特性有所差異[3]。箭葉淫羊藿的凈光合速率（Pn）始終高于擬巫山淫羊藿E.pseudowuhannenseB.L.Guo[4]。適度的高光照強度（以下簡稱光強）可以促進箭葉淫羊藿莖葉分枝數的增加，分枝數的增加帶來產量的顯著增加[5]。“貴同柔毛1 號”因根狀莖芽具有較強萌發能力而具有高產特性，但光強對其分枝數的影響是否與淫羊藿其他基原相似尚無深入研究。淫羊藿中的有效成分為具有異戊烯基取代的黃酮醇苷類成分[6]，本課題組前期研究也發現，適度光強對淫羊藿黃酮醇苷類成分含量的增加有促進作用，如發現（72.7±2.5）μmol·m–2·s–1光強下擬巫山淫羊藿的淫羊藿苷類成分含量最高[7]。發光二極管（LED）光源由于波長易于精準控制，已經成為光合作用研究的主要光源[8]。本研究以“貴同柔毛1 號”為材料，研究柔毛淫羊藿的需光特性及光強對其主要農藝性狀和品質性狀的影響，以期為淫羊藿工廠化生產過程中精細化光調控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

取種植于四川樂山種植基地的1 年生“貴同柔毛1 號”品種健康苗（由樂山市沙灣區長宏中藥材種植專業合作社提供），于2022 年1 月下旬移栽到中國醫學科學院藥用植物研究所溫室中。分單株定植于直徑10 cm、高10 cm 的花盆中，花盆基質為育苗基質-蛭石（3∶1）。2022 年2 月上旬（新葉萌發前），選擇長勢一致（1 年生葉片為7～9 片）的植株移入光培室（溫度：20～25 ℃，相對濕度：60%～70%）中，實驗時間2022 年2 月8 日至2022 年3 月10 日。光強設置4 個梯度，分別是L1[（36.4±5.0）μmol·m–2·s–1]、L2[（91.0±5.0）μmol·m–2·s–1]、L3[（145.6±5.0）μmol·m–2·s–1] 和L4[（200.2±5.0）μmol·m–2·s–1]，光照時間為12 h·d–1，每個光強3 個重復，每個重復9 株，持續培養40 d，每3 d 澆水1次。實驗期間如萌發新分枝為莖（即開花分枝），剪掉幼小花序。

1.2 儀器

L6500K 型全光譜LED 植物專用燈板（寧波楊輝儀器有限公司）；LI-6400 型便攜式光合作用測定儀（美國LI-COR 公司）；SPAD-502型便攜式手持葉綠素儀（日本Konica Minolta Inc公司）；ACQUITY超高效液相色譜系統（美國Waters 公司）；GZX-9070 MBE 型數顯鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（美國Sartorius公司）；FA2104N 型萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷（HPLC 純度>98%，江蘇永健醫藥科技有限公司）；乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，美國Fisher 公司）；實驗用水為娃哈哈純凈水；CO2充氣囊（宜致餐飲科技有限公司）。

2 方法

2.1 分枝數及葉片數測定

在處理10、20、30、40 d 時，分別記錄根狀莖上新萌發的分枝數及新萌發的總葉片數。分枝數類型包括單葉分枝（基生葉，單葉）、三葉分枝（基生葉，3 小葉復葉）、六葉分枝（莖，具2 枚對生的3小葉復葉）。

2.2 光合指標測定

于40 d 時，對4 個光強梯度開展測定，每個處理重復測定4株植物，每株植物選取3枚葉片，選擇同期萌發且已經成熟的葉片進行測定（淫羊藿萌芽到完全展葉約30 d，葉片繼續成熟革質化約10 d[9]），采用光合作用測定儀分別測定Pn、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci），使用葉綠素儀在波長650、940 nm 下測定葉片的葉綠素相對含量（SPAD）值。

2.3 淫羊藿黃酮醇苷類成分的含量測定

于40 d 時，按《中華人民共和國藥典》2020 年版[1]含量測定方法，每個處理重復取9 株植物，每株植物取1片葉片，混合為1個樣品，測定葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4 種淫羊藿黃酮醇苷類成分含量。

2.4 數據分析

數據處理和繪圖采用Microsoft Excel 2010 軟件。單因素方差分析和顯著性檢驗采用SPSS 21.0統計分析軟件。

3 結果

3.1 不同光強對分枝數及總葉片數的影響

在各個處理時期，分枝數都隨光強增加呈現上升趨勢，見圖1。處理10 d，各處理的分枝數均有所增加，差異無統計學意義；處理20 d，L2、L3與L1相比，分枝數增加差異無統計學意義，但L4 顯著增加（P<0.05）；處理30、40 d，各處理間分枝數增加差異有統計學意義（P<0.05），處理30 d，與L1 光強處理相比，L2、L3 和L4 分別增加43.52%、81.40%、100.00%；處理40 d，與L1光強處理相比，L2、L3和L4分別增加39.75%、79.50%、103.57%。對同一處理分析發現，隨著時間推移，“貴同柔毛1號”有新的分枝萌出，L1～L3 處理在30 d 時，分枝數較20 d 時增幅最大，分別為48.52%、70.00%和83.53%，此后增幅下降為44.26%、32.15%和37.81%；L4處理在20 d時，分枝數較前一時期增幅最大，為165.00%，此后增幅有所下降，分別為69.86%和41.11%。對不同處理下的不同時間葉片數進行統計，結果見圖2。葉片數的增加與分枝數的增加呈相同規律。

圖1 不同光強處理不同時期“貴同柔毛1號”的分枝數（,n=9）

圖2 不同光強處理不同時期“貴同柔毛1號”的葉片數（,n=9）

3.2 不同光強對“貴同柔毛1號”光合參數的影響

3.2.1 SPAD 不同光強處理40 d后，葉片的SPAD值隨光強的增加而減少，L1 下的SPAD 值為44.24±2.74。相較于L1，僅L4 下SPAD 值的下降差異有統計學意義（P<0.05），下降了20.21%，L3 的下降趨勢也比較明顯，下降了15.84%（圖3）。

圖3 不同光強處理40 d時“貴同柔毛1號”的SPAD值（,n=4）

3.2.2 光合特性 由圖4 可知，4 種光強處理40 d時，隨著光強的增加，“貴同柔毛1 號”葉片的凈Pn、Tr、Gs總體呈現增加的趨勢。其中，光強對Pn的影響較大，各個光強處理間差異均有統計學意義（P<0.05）。L1下Pn最低，為（1.00±0.20）μmol·m–2·s–1；較L1 處理，L2 處理下Pn增幅為88.07%，L3、L4 處理分別較前一處理的Pn增幅為18.98%和67.14%。L4光強下Pn達到最高，為（3.72±0.28）μmol·m–2·s–1。隨著光強從L1增至L2，Gs和Tr均無顯著增加，當光照強度增至L4 時，兩者均顯著增加（P<0.05），增幅分別為57.44%和41.82%。Ci與Pn的變化趨勢相反，隨著光強的增加而緩慢降低。

圖4 不同光強處理40 d的“貴同柔毛1號”葉片光合特征參數（,n=4）

3.3 淫羊藿黃酮醇苷類成分含量

本研究中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4 種成分隨光強增加，含量均有所增加，但增加規律有所不同（表1）。其中，朝藿定C 與淫羊藿苷的含量占4 種成分總量的70%～80%。隨著光強的增加，朝藿定C 與淫羊藿苷的變化趨勢大致相同，均呈現L1～L4持續增加趨勢；與L2處理相比，L3朝藿定C增幅最大；與L1處理相比，L2淫羊藿苷增幅最大；朝藿定A、朝藿定B均呈現L3處理比L2處理顯著增加，L4處理略有下降的趨勢。L2、L3處理淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量均顯著增加，L3與L4處理間差異無統計學意義。

表1 不同處理40 d的“貴同柔毛1號”4種黃酮醇苷類成分質量分數（,n=3） mg·g–1

表1 不同處理40 d的“貴同柔毛1號”4種黃酮醇苷類成分質量分數（,n=3） mg·g–1

注：不同小寫字母表示同一成分下不同光強處理之間P<0.05。

4 討論

淫羊藿為多年生常綠草本，第1 年秋冬季于根狀莖節上形成休眠芽，第2 年芽萌發長出新枝，新枝的類型包括單葉分枝（基生葉，單葉）、三葉分枝（基生葉，3小葉復葉）、六葉分枝（莖，具2枚對生的3 小葉復葉）3 種類型[10]。常規萌發芽為部分休眠芽（以頂芽為主），營養充分或其他外界條件刺激下，其他休眠芽（根狀莖上的側芽及基部苞片內的側芽）也會萌發。前期已有研究表明，增加光照或者其他因素處理（如激素）可顯著促進擬巫山淫羊藿休眠芽萌發形成新枝[11-12]。

本研究中，光強梯度設置主要基于以下3點：1）本課題組前期對擬巫山淫羊藿30 d 室內控制光強研究結果表明，擬巫山淫羊藿的適宜光強為72～91 μmol·m–2·s–1；2）在產地種植過程中發現，柔毛淫羊藿具有較強的光強耐受能力；3）本課題組對該品種進行了高于擬巫山淫羊藿適宜光強的預實驗（最高設置光強為163 μmol·m–2·s–1），發現該品種耐受高光的能力更強。因此，本研究設置了1 個較低光強L1，1個中等光強L2，2個較高光強L3、L4，研究光強對“貴同柔毛1 號”主要農藝性狀和品質性狀的影響。

本研究結果表明，增加光強可大幅度促進“貴同柔毛1 號”根狀莖上的芽萌發形成新的地上分枝，與本課題組前期對擬巫山淫羊藿[9]和箭葉淫羊藿[13]的研究結果一致。從不同光強處理下分枝數最高增幅出現的時間和增加效應看，隨著光強增加，“貴同柔毛1 號”的分枝數也隨之大量增加，且出現最高增幅的時間變短，如L1～L3處理均在30 d時增幅最高，L4處理下則在20 d達到最高增幅，且增幅約為L3處理的2 倍。本研究中L4 處理已經顯著高于本課題組前期對其他淫羊藿物種光強研究處理，如在相同培養條件下，擬巫山淫羊藿出現顯著光抑制的光強僅為（163.6±2.5）μmol·m–2·s–1，而“貴同柔毛1 號”對于光強增加的適應能力更強。

光強變化可以直接影響植物葉片中葉綠素含量的變化，進而影響植物的光合特性[14]。SPAD 為相對葉綠素含量，與葉綠素含量有極顯著正相關關系[15]。本研究通過對“貴同柔毛1 號”開展40 d 不同光強的研究，發現隨著光強的增加，葉片的SPAD 值逐漸降低，僅L4 處理下SPAD 值顯著下降，其他處理差異無統計學意義；Pn則持續增加。這與Jang 等[16]對2年生人參6月遮陰的研究結果一致。隨著光強的增加，人參也出現SPAD 值小幅度下降，但Pn仍持續增加的結果。結果表明，葉片高Pn的必需條件并不一定是高葉綠素含量，而光強增加引起的葉片葉綠素含量適當降低，在葉綠素合成過程中，將有助于減少葉片氮素的消耗，優化其在葉片內的合理配置；在一定程度上提高光系統Ⅱ的效率，緩解光強增加引起的光抑制現象，最終提高葉片Pn[17]。

本研究結果顯示，光強為L2 時，Pn為（1.87±0.14）μmol·m–2·s–1，光強增至L4 時，Pn達到最高（3.72±0.28）μmol·m–2·s–1。對比前期本課題組潘俊倩[9]對擬巫山淫羊藿和箭葉淫羊藿連續30 d 的光強實驗，兩者Pn均呈現隨著光強的增加，表現出先增加后降低的趨勢，均在72 μmol·m–2·s–1下Pn達到最高，達到1.8～2.0 μmol·m–2·s–1。箭葉淫羊藿在強光145 μmol·m–2·s–1下，Pn能在較長時間維持較高水平；擬巫山淫羊藿的光強耐受能力為18.2～91.0 μmol·m–2·s–1。本結果顯示，隨光照加強，Pn持續增加，一方面可能由于研究中設置的光強尚未達到脅迫光強，另一方面可能是當前光強的處理時間較短，未達到長期的光脅迫效應。綜合比較后得出，“貴同柔毛1 號”比擬巫山和箭葉淫羊藿更能耐受高光強，其在較強光照下仍具有較強的光合能力，有利于其進一步積累光合作用產物，為其高萌發能力奠定基礎。

此外，本研究結果顯示，隨著光強的增加，Ci變化與Pn的變化趨勢呈負相關。這與張勤濤等[18]在LED 黃光不同光強對滇重樓葉片光合特性的影響研究結果一致。Ci變化與Pn的變化呈負相關的結果表明，當前光強尚未達到“貴同柔毛1 號”的光飽和點，光強仍是影響Pn進一步增長的主要因素，推測Pn隨光強增加而增大的原因主要是葉肉細胞的光合活性增大，而不是Ci降低。相反，Ci降低是葉肉細胞的光合活性增大乃至Pn增高的結果[19]。

植物的化學成分及其積累過程受光強影響顯著。“貴同柔毛1 號”光照處理40 d 時，主要成分朝藿定C 和淫羊藿苷在L4 處理下最高，但與L3 處理差別不大；朝藿定A 與朝藿定B 在L3 處理下最高，光強增加到L4 處理有所下降；淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量在上述2 個光強下差異無統計學意義。這與本課題組前期對擬巫山淫羊藿的研究結果[9]有所區別。光照處理30 d 時，隨著光強的增加，擬巫山淫羊藿的4 種主要淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量在（54.6±2.5）μmol·m–2·s–1光強下達到最高，在（90.9±2.5）μmol·m–2·s–1光強下開始顯著下降。相比于擬巫山淫羊藿，“貴同柔毛1 號”淫羊藿黃酮醇苷類成分也能在更高的光強下維持積累的較高水平。此外，在比L4 處理更高的光強及處理時間下，“貴同柔毛1 號”中成分下降的拐點仍有待研究。

綜上所述，“貴同柔毛1 號”在強光下的分枝數增加、Pn增加和淫羊藿黃酮醇苷增加的趨勢和淫羊藿屬其他物種一致，但對更高光強的適應性和耐受性顯著高于其他物種。在柔毛淫羊藿和箭葉淫羊藿的亞熱帶種植區域，夏季高輻射期間，午間75%遮陽網下的光強可達到620 μmol·m–2·s–1，因此耐受高光強的“貴同柔毛1 號”較其他物種和類型具有更好的適應性。如果進行工廠化生產，在淫羊藿未萌發前，給予較強的光照（如L4）可顯著增加分枝數，進而提高葉片生物量，增加淫羊藿黃酮醇苷類成分的含量。“貴同柔毛1 號”對更高光強、更長的作用時間的效果還有待進一步探究。