高壓輸液法沉香通體結香技術的結香效果及所產沉香品質分析△

何欣，黃穎，暴正瀚，孟慧，李浩凌，魏建和，楊云*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193；

2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護與開發重點實驗室/國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室，海南 海口 570311

沉香為常綠喬木瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（AquilariaLam.）或擬沉香屬（GyrinopsGaertn.）植物含樹脂的木材[1]。白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg 是我國出產沉香的主要樹種，也是《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載的國產藥用沉香的唯一正品基原植物[2]。沉香作為傳統名貴藥材和“龍檀沉麝”四大名香之首的貴細香料，在中國、馬來西亞、老撾、越南等國家和歐美地區國家應用廣泛[3-5]。但由于長期無節制砍伐，沉香屬植物資源逐漸減少，已達瀕危[6-7]。目前，所有沉香屬及擬沉香屬物種均被列為瀕危物種[8]。

種植的白木香樹需要遭受外界傷害（真菌侵染或物理、化學傷害），經長時間積累，才能誘導產生沉香[9]。為了解決野生資源瀕危、市場高品質沉香資源短缺的問題，許多人工誘導技術被發明應用于沉香生產[10-15]。通體結香技術（Agar-WIT）[15-16]作為目前中國和世界其他沉香產區應用最廣泛的人工結香技術，具有成本低、產量高、操作簡便等特點[17-18]，所產通體香具有藥用安全性[19-20]，明顯優于火烙法、結菌法、半斷干法等其他傳統人工結香技術[12]，已在中國及東南亞國家超45 萬株沉香樹上使用[21]。其具體操作方法為選擇晴天在距離地面50 cm 處的白木香樹體上鉆孔，孔深至木質部，用輸液裝置輸送結香液至小孔內，通過植物自身的蒸騰作用將高效安全的結香液輸送至植物的莖干、枝條等部位，6～12 個月后，可在樹干中形成沉香，而后整株伐倒即得[22]。

近年來，通體結香技術被廣泛應用于許多國家的沉香生產，為了該技術能更好地應用和推廣，有學者對結香產地[8,18,21]、結香時間[23-24]、白木香胸徑、鉆孔高度[25]等通體結香技術影響因素及其對產香的影響進行了探究，但尚未有對該技術本身操作優化升級的研究報道。因此，本研究探究高壓輸液的最佳輸液壓力，在晴天、雨天、夜晚、低溫結香環境下，通過對比高壓輸液和常壓輸液2 種通體結香技術的輸液時間，分析2 種通體香的性狀、顯微結構、結香率、浸出物、特征圖譜及沉香四醇質量分數，評價高壓輸液法通體結香技術的可行性，為通體結香技術的升級和在國內外更好地應用推廣提供依據。

1 材料

1.1 樣品

沉香采自中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所海口研發中心，為試驗田5 年生白木香樹。選取樹體直徑7 cm 左右（離地1 m 處）、無蟲蛀霉斑、外觀健康、無結香痕跡的筆直單桿樹，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所楊云研究員鑒定為白木香Aquilria sinensis（Lour.）Gilg。憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標本館。

1.2 儀器

CM1950 型冰凍切片機（德國Leica 公司）；ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會社）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；Mili-Q 型純水儀（美國Millipore 公司）；2695/2475型高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]；AL104-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB25-12DTDN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070A型恒溫電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）。

1.3 試藥

沉香四醇對照品（批號：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對照藥材（批號：121222-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；“通香一號”結香液為本課題組發明的沉香誘導結香液；FSC 22 Blue 冷凍包埋劑（美國Surgipath 公司）；GF254薄層色譜板（批號：HX17444229，德國Merck 公司）；乙腈、甲酸（HPLC 級，賽默飛世爾科技中國有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 結香處理

高壓輸液壓力考察：在距離地面1 m 處，沿樹體垂直方向鉆2 個小孔，輸液管連接高壓輸液瓶，分別在常壓和10、20、30 MPa 4 種不同壓力下采用通體結香技術輸液處理，每個處理重復3 次，記錄輸液時間，確定高壓輸液的最佳壓力。

通體結香處理：在晴天、雨天、夜晚、低溫條件下，按上述結香操作步驟，分別于20 MPa和常壓下采用通體結香技術結香，每個處理重復3 次，記錄輸液時間，結香6個月后收樣，樣品信息見表1。

表1 高壓不同結香環境條件的沉香樣品信息

2.2 樣品前處理

伐倒的整棵沉香樹鋸掉樹枝和上下方白木部分，剝除外皮，截成長20 cm 的小段，干燥，留取部分沉香樣品塊用于后續結香率計算及顯微鑒別，按海南省地方標準《白木香通體結香樹木剖香技術規程》（DB45/T 257—2013）[26]要求，將白木和腐爛部位等未結香部分剔除，剖取沉香，香片打粉后分別過二號篩和三號篩，備用。

2.3 沉香結香率計算

采收后的沉香樹段分別于上、中、下3 段位置，切取厚度為3 cm 左右的莖段。正上方分別拍取各莖段的橫截面圖，按公式（1）計算每棵樹的結香率。采用Photoshop 像素法[24]計算出各莖段的橫截面平均像素（NC）和結香區域平均像素（NA），結香區域與橫截面像素數之比等于結香層面積（SA）與橫截面面積（SC）之比，即每株樹的結香率。

2.4 顯微鑒別

將厚度約為0.5 cm 的沉香樣品在70 ℃熱水浴中浸泡6 h 直至沉香樣品塊完全軟化，取出晾干后，修剪成合適大小的方形樣品小塊（包含腐爛層、沉香層和白木層），用適量冷凍包埋劑包埋，冷凍切片機切取100 μm 的薄片，水合氯醛透化劑中透化6 h，裝片，置于4 倍物鏡的顯微鏡下觀察。

2.5 浸出物

按《中國藥典》2020 年版（四部）[27]通則2201項下醇溶性熱浸法測定浸出物含量。

2.6 薄層鑒別

稱取混合均勻的沉香樣品粉末（過二號篩）0.5 g，乙醚30 mL提取，超聲振蕩1 h，濾過，蒸干濾液，殘渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。參照《中國藥典》2020年版[2]薄層色譜法（通則0502），吸取上述2種溶液10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.7 特征圖譜和沉香四醇含量測定

按照《中國藥典》2020 年版方法[2]測定特征圖譜和沉香四醇含量。

3 結果

3.1 確定高壓輸液最佳壓力

輸液法通體結香技術不同輸液壓力的輸液時間見圖1。不同輸液壓力輸液時間差異有統計學意義（P<0.01），10、20、30 MPa較常壓均能大幅度縮短通體結香技術輸液時間，高壓輸液效率較常壓可提高216%～497%。其中，20 MPa 壓力下輸液時間最短，輸液效率最高，平均輸液時間為31 min，較常壓輸液效率提高497%，為高壓輸液最佳壓力。

圖1 輸液法通體結香技術不同輸液壓力的輸液時間（,n=3）

3.2 輸液時間

高壓輸液法通體結香技術的輸液時間見圖2。與常壓相比，20 MPa在晴天、夜晚、雨天、低溫4種結香環境下，均能顯著縮短輸液時間（P<0.01），輸液效率可提高129%～497%，以晴天時提高效果最顯著，輸液時間可縮短83%。其中，20 MPa 組和常壓均以晴天時的輸液時間最短，優于其他三組，不同結香環境條件輸液時間從短到長分別為晴天、夜晚、低溫、雨天。

圖2 高壓輸液法通體結香技術的輸液時間（,n=3）

3.3 性狀

高壓輸液法通體結香技術所產沉香的橫截面見圖3，由內至外可分為腐爛層、沉香層、過渡層和白木層。20 MPa 組通體香沉香層顏色較常壓深，且均有點狀沉香向外擴散的趨勢。晴天20 MPa 組通體香沉香層與常壓相比，從偶見淺褐色虛線變為棕黑色連續實線，且在環形沉香層外可見1 圈明顯的棕色星點狀溢出，晴天組均無明顯阻隔層形成。夜晚20 MPa 組通體香較常壓通體香沉香層顏色加深，阻隔層明顯減少，由淺棕色虛線，可見1 圈較厚白色阻隔層變為一半為深棕色實線、一半為淺棕色虛線，阻隔層僅虛線部分可見。雨天、低溫20 MPa 組通體香沉香層呈現明顯棕黑色實線，且有深棕色星點狀溢出，雨天20 MPa 組未見明顯阻隔層形成，雨天常壓有較少不明顯阻隔層。

圖3 高壓輸液法通體結香技術所產沉香性狀

3.4 結香率

通體結香技術通過高壓輸液產沉香的結香率見圖4，20 MPa 組通體香的平均結香率為11.69%，與常壓通體香的平均結香率（10.82%）差異無統計學意義。其中，20 MPa 組和常壓組中晴天、雨天、低溫的結香率差異無統計學意義；常壓夜晚時的結香率顯著低于晴天（P<0.05），僅為8.15%。

圖4 高壓輸液法通體結香技術所產沉香的結香率（,n=3）

3.5 顯微特征

高壓輸液法通體結香技術所產沉香的顯微結構見圖5，所有樣品均可觀察到導管、射線和木間韌皮部等顯微結構；木間韌皮部呈“島”狀、條帶狀或橢圓狀，細胞壁薄，內含黃棕色或棕色樹脂；射線寬1～2 列細胞，呈類長方形；充滿黃棕色或棕色樹脂，多與木間韌皮部相交；導管呈多角形或類圓形的單孔或復孔，少數導管有樹脂填充。20 MPa 組通體香木間韌皮部樹脂較常壓色度深、填充度高，與性狀觀察結果一致。晴天、夜晚、雨天、低溫不同結香環境條件的木間韌皮部樹脂的填充度和色度也存在一定差異，晴天組樹脂呈黃棕色或棕褐色，明顯優于其他三組。夜晚常壓觀察到明顯的阻隔層結構，雨天常壓、雨天20 MPa 組、低溫20 MPa 組觀察到木間韌皮部異常膨大，上下2 個相連成團狀，推測為阻隔層形成的前體結構。

圖5 高壓輸液法通體結香技術所產沉香顯微特征（×4）

3.6 沉香的浸出物含量

高壓輸液法通體結香技術所產沉香的浸出物質量分數見圖6，20 MPa 壓力不同結香環境條件下所產通體香的浸出物質量分數均已達到《中國藥典》2020 年版標準，按浸出物質量分數高低排序分別為晴天（16.33%）、低溫（15.24%）、雨天（14.89%）和夜晚（14.11%），平均浸出物質量分數為15.14%，與常壓通體香平均浸出物質量分數（13.61%）差異無統計學意義。常壓晴天、雨天、低溫時通體香的浸出物質量分數均大于10.0%，且與20 MPa 組差異無統計學意義。常壓夜晚時通體香的浸出物質量分數最低，僅為9.66%，未達到《中國藥典》2020年版標準，顯著低于其他處理（P<0.05）。

圖6 高壓輸液法通體結香技術所產沉香的浸出物質量分數（,n=3）

3.7 沉香的薄層色譜

高壓輸液法通體結香技術所產沉香樣品的薄層色譜鑒別見圖7。所有樣品薄層色譜上的熒光斑點與沉香對照藥材一致。結果表明，高壓輸液法通體結香技術在晴天、夜晚、雨天、低溫不同結香環境條件下結香處理獲得的樹脂均為沉香，符合《中國藥典》2020年版標準。

圖7 高壓輸液法通體結香技術所產沉香樣品的薄層色譜圖

3.8 沉香四醇含量測定

高壓輸液法通體結香技術所產沉香的沉香四醇質量分數見圖8。高壓輸液法通體結香技術所產沉香的沉香四醇質量分數均大于0.1%，符合《中國藥典》2020年版標準。20 MPa 組通體香的沉香四醇質量分數為0.27%～0.65%，平均值為0.45%，與常壓通體香沉香四醇的平均質量分數（0.54%）差異無統計學意義。常壓中晴天的通體香沉香四醇質量分數最高，為0.77%，夜晚時最低為0.18%。晴天、雨天、低溫時20 MPa組與常壓組通體香沉香四醇質量分數差異無統計學意義，常壓夜晚時的沉香四醇質量分數顯著低于20 MPa組（P<0.05）。

圖8 高壓輸液法通體結香技術所產沉香的沉香四醇質量分數（,n=3）

3.9 特征圖譜

高壓輸液法通體結香技術所產沉香特征圖譜見圖9。通過高壓輸液和常壓輸液所產沉香樣品的特征圖譜均有6 個特征峰，與《中國藥典》2020 年版沉香特征圖譜的6 個特征峰相對應，符合《中國藥典》2020年版標準。

圖9 高壓輸液法通體結香技術所產沉香特征圖譜

4 討論

實際生產中，通體結香技術受天氣影響較大，為了達到較好的輸液效果，通常需要在晴朗、光照充足、溫度>25 ℃的上午結香[22]。但本研究中常壓操作時僅晴天的輸液時間就長達3 h，夜晚、低溫、雨天等條件下輸液時間更長，如雨天的輸液時間甚至是晴天的6.5 倍。這說明常壓操作存在輸液時間較長的特點，且無法實現全年、全天結香，大大降低了該通體結香技術實施的效率。本研究發現，通過提高輸液壓力能顯著減少通體結香技術的輸液時間，晴天、夜晚、低溫和雨天20 MPa壓力輸液（簡稱高壓輸液）通體結香技術的輸液效率能提高129%～497%，高壓輸液時晴天的輸液時間可縮短到31 min，大大節約了實際生產中的操作時間。因此，高壓輸液能打破環境條件對通體結香技術的應用限制，大幅度提高輸液效率，適用于實際生產。

本研究中高壓通體香的品質均符合《中國藥典》2020 年版標準，平均結香率、平均浸出物質量分數和平均沉香四醇質量分數分別高達11.69%、15.14%和0.45%，與常壓結果差異無統計學意義。晴天、雨天、低溫時高壓通體香與常壓通體香的結香率、浸出物含量和沉香四醇含量差異無統計學意義，品質較為相似；夜晚高壓通體香的浸出物含量和沉香四醇含量顯著高于常壓通體香，品質優于常壓。這說明高壓輸液不會對通體結香技術造成不利影響，不會降低所產通體香品質。本研究還發現，各環境條件下高壓輸液通體香與常壓輸液通體香的浸出物含量與沉香四醇含量無正向相關性。此外，本課題組前期研究發現，通體結香技術產生沉香的過程會伴隨阻隔層的形成，即在沉香層和過渡層之間形成1 圈約1～5 mm 厚的白色帶狀結構。阻隔層的形成原因是沉香層外圍的部分木間韌皮部脫分化重新分裂，這是為了將受到傷害的組織和健康組織分隔開，阻止傷害在樹體內擴展[28]。本研究中也觀察到部分常壓輸液通體香有1 圈明顯較厚的阻隔層，而高壓輸液通體香阻隔層明顯減少，較常壓輸液在環形結香層外出現結香點狀向外擴散現象，推測高壓有可能延緩阻隔層的形成和積累，但該結論還需進一步驗證。

針對全球高品質沉香需求越來越多的現狀，結香技術也亟待升級更新。本研究采用高壓操作對通體結香技術進行優化升級，在晴天、夜晚、雨天、低溫4 種不同結香環境條件下，探究高壓輸液對通體結香技術輸液效率及產沉香品質的影響，結果表明20 MPa為高壓輸液法通體結香技術的最佳輸液壓力，能顯著提高通體結香技術的輸液效率，突破天氣和氣候的限制，可在夜晚、雨天、低溫等環境開展結香工作且不影響所產沉香品質，具有可行性和可操作性。研究結果為通體結香技術的升級和實際應用推廣提供了依據和參考。