高分辨非靶代謝組學方法研究臻通集膠囊對高脂血癥模型大鼠的影響△

侯紅平，王彩霞，魏曉露，高云航，趙曉曉，宋玲，陳騰飛，練東銀，李麗麗，彭博*，張廣平*

1.中國中醫科科學院 中藥研究所，北京 100700；

2.河北御芝林生物科技有限公司，河北 石家莊 050035

血脂異常通常表現為血總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低及上述血脂異常共同存在的混合型血脂異常，根據病因可分為原發性和繼發性2 類，前者多見于遺傳性疾病，后者主要見于糖尿病、肝腎疾病等全身性系統性疾病。2017 年全球疾病負擔（global burden of disease，GBD）的中國資料表明，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）異常是中國心血管疾病（CVD）的第三大歸因危險因素[1]。而2012—2015 年心血管健康研究（CHS）顯示，在我國年齡≥35 歲的居民血脂異常總體患病率為34.7%，知曉率、治療率、控制率分別為16.1%、7.8%、4.0%，整體控制情況較差[2]。因此，對高脂血癥預防和治療的研究具有非常重要的意義。

臻通集膠囊是以三七粉、黃芪提取物、丹參提取物、銀杏葉提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物為主要原料制成的保健品。上述成分經實驗證明具有輔助調血脂和增強免疫力的作用[3-5]，在本課題組前期實驗中也證實臻通集膠囊能夠改善血脂異常的癥狀[6]，但其調節血脂代謝的機制尚不明確。本研究通過高分辨非靶代謝組學方法研究臻通集膠囊對高脂血癥模型大鼠的影響，為其治療和預防高脂血癥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TBA-120FR 型全自動生化分析儀（佳能集團）；Triple TOF 6600 型質譜儀（AB Sciex 公司）；5430R型低溫高速離心機（Eppendorf 公司）；1290 Infinity LC型超高壓液相色譜儀（Agilent公司）。

1.2 試藥

臻通集膠囊（批號：202102010702，河北御芝林藥業有限公司）；TG 試劑盒（批號：01130C11）、TC 試劑盒（批號：01126D11）、HDL 試劑盒（批號：10222A11）、LDL 試劑盒（批號：10223A11）均購于北京安圖生物工程有限公司；乙腈（Merck公司）；甲醇（Fisher公司）。

1.3 實驗動物

無特定病原體（SPF）級SD 大鼠40 只，雄性，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，飼養于中國中醫科學院中藥研究所屏障環境動物房，實驗經中國中醫科學院中藥研究所動物福利倫理委員會批準（倫理批準號：2021B125）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

隨機取6 只大鼠作為對照組，給予正常飼料，其余所有大鼠給予高脂飼料（基礎飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉），連續喂養4 周后，檢測動物血清中的TG 和TC，與對照組比較明顯升高且差異具有統計學意義，視為模型成功。剔除不合格大鼠，其余大鼠根據TC值隨機分層分組，分為模型組和高、中、低劑量給藥組，每組6只。

對照組大鼠正常飲食。模型組和給藥組大鼠給予高脂飼料的同時，高、中和低劑量組分別給予臻通集膠囊0.432、0.216、0.108 g·kg–1（2.0、1.0、0.5 倍臨床等效劑量），灌胃給藥，每天1 次，連續給藥8周。

2.2 動物處理及指標檢測

末次給藥后，大鼠麻醉，腹主動脈采血，離心分離血清，全自動生化儀檢測血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的含量。取部分中劑量的大鼠肝組織用于高分辨非靶代謝組學的研究。

2.3 高分辨非靶代謝組學分析

2.3.1 肝臟組織提取方法 大鼠肝臟組織解凍，取適量樣本加入預冷的甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1），渦旋混合，低溫超聲30 min，–20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，真空干燥，質譜分析時加入乙腈水溶液（乙腈-水，1∶1）100 μL復溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心 15 min，取上清液進樣分析。

2.3.2 質量控制（QC）樣本制備 QC 樣本是由待測樣本等量混合制成，在待測樣本超高效液相色譜-質譜法（UPLC-MS/MS）進樣前、進樣中和進樣后上機檢測。

2.3.3 色譜-質譜分析 色譜條件：Agilent 1290 Infinity LC型超高效液相色譜系統（Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 型色譜柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為25 ℃；流速為0.5 mL·min–1；進樣量為2 μL；流動相A 為水+25 mmol·L–1乙酸銨+25 mmol·L–1氨水，流動相B 為乙腈；梯度洗脫（0～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，95%～65%B；7.0～8.0 min，65%～40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%～95%B；9.1～12.0 min，95%B）。

質譜條件：采用Triple TOF 6600 型質譜儀進行樣本一級、二級譜圖的采集。分別采用電噴霧離子源（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。

2.4 數據處理

血脂水平的數據以（-x±s）表示，采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。代謝組學數據經ProteoWizard 3.0.6428軟件轉換成.mzXML 格式，然后采用XCMS 84 軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對XCMS 提取得到的數據首先進行代謝物結構鑒定、數據預處理，再進行實驗數據質量評價和數據分析。

3 結果

3.1 大鼠血清中的血脂水平檢測

與對照組比較，模型組大鼠血清中TG、TC、HDL-C 和LDL-C 水平均明顯升高，差異具有統計學意義，說明造模成功。臻通集膠囊高劑量能明顯降低大鼠各項指標的水平（P<0.05，P<0.01），中劑量能降低TG、TC 和LDL-C 水平（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

表1 各組大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 實驗方法考察

3.2.1 QC 樣本相關性 對QC 樣本進行Pearson 相關性分析，相關性圖譜見增強出版附加材料。一般r>0.9 表明相關性較好。實驗結果表明，QC 樣本間的r均大于0.9，說明實驗重復性較好。

3.2.2 總體樣本Hotelling′s T2 檢驗 Hotelling′sT2檢驗通過多元變量建模對樣本進行檢驗，定義了95%或99% 置信區間，可用于離群樣本的診斷。Hotelling′sT2 檢驗結果見圖1。結果表明QC 樣本均在99%置信區間內[7]，說明實驗的重復性好。

圖1 臻通集膠囊給藥后大鼠血清總體樣本Hotelling′s T2檢驗

3.3 總體樣本主成分分析（PCA）

將所有實驗樣本和QC 樣本提取得到的峰進行PCA，見圖2。實驗結果表明，正、負離子模式下QC樣本緊密聚集在一起，說明實驗的重復性好。同時，對照組和模型組明顯分離，說明模型成功。經臻通集膠囊給藥后，各組均向對照組方向回調，說明臻通集膠囊對高脂血癥具有良好的干預作用。

圖2 臻通集膠囊給藥后大鼠血清總體樣本PCA

3.4 代謝組學分析

3.4.1 差異代謝物的篩選結果 與對照組比較，模型組共檢測出138 個差異代謝物；與模型組比較，臻通集膠囊給藥組共檢測出123 個差異代謝物，正離子模式的72個差異代謝物有24個在給藥后得到了糾正，負離子模式的51 個差異代謝物有9 個在給藥后得到了糾正（表2、表3）。其中，變量重要性投影（VIP）值表示變量投影重要度，值越大，表示越重要；P值越小，表示差異越顯著[8]。

表2 臻通集膠囊給藥組和模型組在正離子模式下的差異代謝物

表3 臻通集膠囊給藥組和模型組在負離子模式下的差異代謝物

3.4.2 差異代謝物表達差異倍數分析 以差異代謝物的log2FC（FC 為差異倍數）為橫坐標，顯著性差異代謝物為縱坐標，分析給藥組和模型組的差異代謝物表達，并對差異代謝物進行分類。正離子模式的差異代謝物主要包括L-肉堿、甜菜堿、胞苷、L-脯氨酸肉堿、亞油酸肉堿、DL-苯丙氨酸、UDP-D-半乳糖；負離子模式的差異代謝物主要包括肌苷、替尼泊苷、亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、亮氨酸、D-脯氨酸、甲基丙二酸等。差異代謝物表達差異倍數分析及分類見增強出版附加材料。

3.4.3 差異代謝物的亞類分析 給藥組和模型組差異代謝物進行亞類分析，正離子模式的差異代謝物亞類主要集中在哌啶、脂肪酰基、鞘脂、呋喃、肽模擬物等方面；負離子模式的差異代謝物亞類主要集中在甘油磷脂、類黃酮、嘌呤核苷酸和香豆素等方面。差異代謝物表達差異火山圖及亞類分析圖見增強出版附加材料。

3.4.4 差異代謝物生物信息學分析

3.4.4.1 聚類分析 顯著性差異代謝物（VIP值>1，P<0.05）的層次聚類分析結果顯示，聚在同一簇內的代謝物具有相似的表達模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程和細胞通路。正離子模式的差異代謝物主要聚集在腺苷5-單磷酸、還原型甘油磷酸膽堿、脫氧腺苷、半胱氨酸-甘氨酸、L-谷胱甘肽等方面，負離子模式的差異代謝物主要聚集在L-谷氨酰胺、尿酸、腺嘌呤、抗壞血酸、谷氨酸、D-脯氨酸等方面。顯著差異代謝物的層次聚類分析圖見增強出版附加材料。

3.4.4.2 相關性分析 對顯著性差異代謝物間的代謝密切程度進行相關性分析。正、負離子模式均集中在脂質、核酸、有機酸及其衍生物、有機氮化合物、有機氧化合物等方面。顯著性差異代謝物的相關性網絡圖見增強出版附加材料。

3.4.4.3 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路注釋與分析 將正、負離子模式篩選到的差異代謝物合并，對其進行KEGG（http://www.kegg.jp/）通路注釋與分析，見圖3。然后對KEGG 代謝通路整體變化進行差異豐度得分分析，見圖4。涉及的代謝通路包括雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、環磷酸鳥苷酸依賴性蛋白激酶（cGMP-PKG）信號通路、叉頭轉錄因子（FoxO）信號通路、蛋白質消化和吸收、嘧啶代謝、微生物消化和吸收、甘油磷脂代謝、氨基酸生物合成、嘌呤代謝等。

圖3 臻通集膠囊給藥組和模型組大鼠血清中差異代謝物KEGG通路富集分析

4 討論

代謝組學主要通過對特定細胞、器官或生物體中的低相對分子質量代謝物（<2000）進行定量分析，是1999 年由Nicholson 等[9]提出，主要用來研究生物體受刺激后所發生的各種代謝應答變化，可以直觀反映機體的代謝狀況。目前，代謝組學最常用的判別歸類分析方法包括以PCA 為主的無監督的判別分析方法及以偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）為主的有監督的判別分析方法[10]。

本研究中，模型組大鼠血清中的TG、TC、HDL-C 和LDL-C 較對照組均明顯升高，且PCA 顯示，對照組和模型組分離明顯，說明模型成功。而臻通集膠囊給藥后，高劑量和中劑量組的TG、TC、LDL-C，高劑量組的HDL-C 較模型組明顯降低，且差異有統計學意義。中劑量為臻通集的有效劑量，在此基礎上，比較了模型組和臻通集中劑組的代謝組學差異。

前期進行了實驗方法學的考察，QC樣本間的相關性系數均大于0.9，且QC 樣本均在置信區間內，表明實驗的重復性較好。PCA 顯示，經臻通集膠囊給藥后，各組均向對照組方向回調，說明臻通集膠囊對高脂血癥具有良好的干預作用，與上述血脂水平變化相一致。與對照組比較，模型組共檢測出138 個差異代謝物，其中正離子模式有66 個差異代謝物，負離子模式有72 個差異代謝物。給藥組與模型組比較，共檢出123 個差異代謝物，其中正離子模式有72 個差異代謝物，主要包括甘油磷酸膽堿、氨基酸、腺苷、谷胱甘肽、磷酸膽堿、胞嘧啶、乳酸、l-花生四烯酰肉堿等；負離子模式有51 個差異代謝物，主要包括尿嘧啶、氨基酸、谷氨酸、尿酸、吲哚乳酸、腺嘌呤等。上述差異代謝物主要集中在木脂素、新木脂素及相關化合物，羧酸及其衍生物，肉桂酸和衍生物，香豆素及其衍生物，吲哚類衍生物，異黃酮，木脂素內酯，有機磷酸和衍生物等。

經生物信息學分析，臻通集干預大鼠高脂血癥的代謝過程涉及多個信號通路，主要包括mTOR 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、FoxO 信號通路、蛋白質消化和吸收、嘧啶代謝、微生物消化和吸收、甘油磷脂代謝、氨基酸生物合成、嘌呤代謝等。這與臻通集含有銀杏葉提取物、葛根提取物、余甘子提取物等多個調脂成分密切相關[11-12]。

磷脂腺肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-mTOR信號通路是典型的自噬通路，該通路通過調節蛋白質合成和降解、改善細胞能量代謝等多種途徑發揮重要的生理功能，激活該通路可增強肝臟細胞的自噬表達，能夠有效調節血脂、改善肝臟脂質沉積等[13-14]。FoxO1是位于PI3K/Akt下游的關鍵因子，在肝臟糖脂代謝的調節中具有至關重要的地位。研究表明，通過調節PI3K/Akt 通路，促進FoxO1 磷酸化，能夠調節血脂水平，緩解高脂血癥[15-18]。文獻報道，次黃嘌呤異構體別嘌呤醇能夠改善患者高尿酸血癥，利于改善患者的血脂代謝情況[19]。李玉紅等[20]研究發現，糖脂清可以改善四氧嘧啶糖尿病小鼠的生長狀況，降低小鼠空腹血糖濃度和血清中TG的含量，提示嘧啶代謝參與血脂水平的調節。

綜上，臻通集膠囊能夠有效改善高脂血癥大鼠的血脂水平，與其能夠調節嘌呤代謝、嘧啶代謝、甘油磷脂代謝、mTOR 信號通路，cGMP-PKG 信號通路等密切相關。