β4GalT1-CD200R1 復合物在小膠質細胞炎性活化中的作用*

楊 杰，劉 超，段程偉

（1 南通大學附屬南通第三醫院/南通市第三人民醫院神經外科，江蘇 226006；2 蘇州市吳江區第一人民醫院檢驗科；3 南通大學第二附屬醫院/南通市第一人民醫院臨床醫學研究中心）

小膠質細胞活化介導的炎癥反應是中樞神經系統退行性疾病的共同特征[1]。β1,4-半乳糖基轉移酶-1（beta 1,4-galactosyltransferase I,β4GalT1）是一種糖基轉移酶[2],參與神經炎癥的發生發展[3],在神經系統疾病中發揮重要作用。既往研究大多側重β4GalT1 對細胞內信號轉導的調控,尚不清楚該酶是否通過調節底物N-糖基化修飾而參與小膠質細胞活化。CD200R 是I 型跨膜糖蛋白,有CD200R1、CD200R2、CD200R3 和CD200R4 四種亞型,在中樞神經系統中CD200R1 主要表達于小膠質細胞,是CD200 的受體,CD200 主要表達于神經元表面[4]。CD200 與CD200R 結合能使小膠質細胞處于靜息狀態[5]。當CD200-CD200R 結合異常時,小膠質細胞活化增加,引起神經元損傷[6]。本研究分析β4GalT1 對CD200R1 N-糖基化的調節及其在小膠質細胞炎性活化和神經元損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞模型 采用小鼠BV2 小膠質細胞株和人源胚胎腎細胞（HEK239T 細胞）（中國科學院上海細胞庫）,加入DMEM 完全培養基（Thermo,11965092,含10%FBS、100 U/mL 青毒素、100 U/mL 鏈霉素）,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養箱培養,待細胞貼壁后進行相關實驗。

1.2 原代皮層神經元培養 在生物安全柜內以75%酒精浸泡消毒,快速取出小鼠腦組織,以4 ℃預冷D-Hank 液沖洗,仔細剝離腦膜、血管。將腦組織置于D-Hank 液中剪碎,放入15 mL 離心管中,加入等量D-Hank 液和0.25%胰酶（Sigma,T4049）,置于37 ℃恒溫培養箱內8 min,每隔3 min 搖晃1 次使消化完全。取出培養瓶,加入適量DMEM 完全培養基以終止消化。500 r/min 離心5 min,棄去上清液,加入適量DMEM 完全培養基,吸管反復吹打30 次使細胞呈懸濁狀,靜置5 min,留取上清液,400 目濾網過濾。將細胞懸液接種于培養瓶,細胞濃度5×105/cm3,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。4 h 后培養基更換為神經元培養液,3 d 后換全液,依細胞生長情況,每3～4 d 換半液。

1.3 β4GalT1 和CD200R1 表達載體的構建與鑒定 pcDNA3.1myc-β4GalT1 表達載體已由本實驗室構建。CD200R1 表達載體構建:從相關網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）獲取小鼠CD200R1基因mRNA 序列,利用Premier 5.0 軟件設計Flag-CD200R1 載體上下游引物,sense:5＇-CGGAATTCAATGTTTTGCTTTTGGAGA-3＇,antisense:5＇-GGGGTACCAGATTCCAATGGCCGAC-3＇,分別含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。提取小鼠皮層制備RNA,進行逆轉錄反應獲取cDNA,利用PCR 反應結合上述全長引物,擴增CD200R1 的全長cDNA,然后進行連接、轉化和Sanger 法測序鑒定構建Flag-CD200R1 載體。隨后根據Lipofectamine 2000 說明書,采用瞬時轉染進行后續實驗。

1.4 酶聯免疫吸附法（ELISA） 運用ELISA 試劑盒（Abcam 公司）檢測BV2 細胞中炎癥因子iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 的表達,按試劑盒說明操作。將濃縮洗滌液稀釋至工作濃度,標準品稀釋至所需濃度,混勻后靜置20 min。臨用前將濃縮的生物素化抗體用稀釋液按比例稀釋,配制成抗體工作液。將標準品和樣品加入ELISA 板條相應孔中,100 μL/孔。封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置90 min,洗板3次。每孔滴加生物素化抗體工作液100 μL,封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置60 min,洗板3 次。每孔滴加酶結合物工作液100 μL,用封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置30 min,洗板3 次。每孔滴加顯色液100 μL,37 ℃恒溫箱中避光靜置10～15 min。最后多功能酶標儀檢測450 nm 處吸光值。空白孔不作任何處理。

1.5 Western Blot （1）配制膠板;（2）樣品處理:蛋白樣品于恒溫金屬浴中37 ℃解凍,13 000 g,4 ℃離心1 min,置于冰上;（3）上樣:將樣品加入上樣孔,110 V 電泳70 min 左右;（4）轉膜:采用PVDF 膜,恒流300 mA 轉膜90 min;（5）封閉:5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜2 h;（6）一抗孵育:按照相應稀釋比用一抗稀釋液稀釋抗體,置于4 ℃冰箱孵育過夜;（7）二抗孵育:洗膜3 次,每次10 min。將膜置于稀釋好的二抗中,室溫孵育2 h;（8）顯影:洗膜3 次,ECL 顯影,采用圖像分析軟件進行分析。

1.6 免疫共沉淀 以中效RIPA 裂解液[含50 mmol/L Tris（pH 7.4）,150 mmol/L NaCl,1%NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1×protease inhibitor cocktail 和1×phosphatase inhibitor cocktail]裂解細胞,15 000 g,4 ℃離心20 min,吸取上清。取20 μL 上清液作為Input,其余上清液以磁性的protein A/G beads 預澄清后分為均等的3 份,分別加入對照IgG、抗myc 和Flag 抗體,4 ℃孵育輪轉過夜。加入30～40 μL 磁性protein A/G 珠,繼續4 ℃孵育輪轉過夜。以中效RIPA 裂解液洗滌5 次,加入20 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液,以Western Blot 法檢測myc 和flag 相互結合情況。

1.7 統計學處理 應用SPSS 20.0 和Sigma Plot 10.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s 表示,兩組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β4GalT1 與CD200R1 在HEK239T 細胞中存在相互作用 將myc-β4GalT1 和Flag-CD200R1 野生型全長質粒共轉入HEK293T 細胞內,免疫共沉淀結合Western Blot 技術發現β4GalT1 與CD200R1 存在相互作用（圖1）。

圖1 β4GalT1 與CD200R1 在HEK239T 細胞中存在相互作用

2.2 β4GalT1 與CD200R1 在BV2 細胞中存在相互作用 將myc-β4GalT1 和flag-CD200R1 野生型全長質粒共轉入BV2 細胞中,免疫共沉淀結合Western Blot 技術發現β4GalT1 和CD200R1 也存在相互作用（圖2A）,細胞免疫熒光檢測顯示在正常組和LPS 處理組中,β4GalT1 和CD200R1 共定位于細胞膜（圖2B）。

圖2 β4GalT1 與CD200R1 在BV2 細胞中存在相互作用

2.3 β4GalT1 調節CD200R1 N-糖基化修飾 免疫共沉淀和凝集素（RCA-1）印跡技術檢測結果表明,CD200R1 的N-糖鏈含有β-1,4-糖苷鍵（圖3A,3B）。BV2 細胞轉染myc-β4GalT1 或si-β4GalT1 后,顯示β4GalT1 對CD200R1 的N-糖基化有調節作用（圖3A,3B）。本實驗顯示44 號位突變后糖鏈表達減弱（圖3C,3D）,表明CD200R1 存在著N-糖基化修飾,β4GalT1 參與CD200R1 的N-糖基化。

圖3 β4GalT1 調節CD200R1 的N-糖基化修飾

2.4 N44Q 不改變CD200R1 的細胞定位 上述實驗結果提示CD200R1 44 號位糖基化位點與CD200-CD200R1 的結合有關,為進一步研究該位點對CD200R1 的影響,我們在BV2 細胞中分別轉染flag 標記的野生型CD200R1（wtCD200R1）和N44Q 24 h 后,使用免疫熒光顯微鏡檢測外源性wtCD200R1和N44Q 的定位,顯示野生型組和突變組中CD200R1 定位均未發生改變（圖4）。

圖4 44 號位突變前后CD200R1 細胞定位

2.5 N44Q 突變促進BV2 細胞炎性活化 在培養的BV2 細胞中加入CD200Fc 與CD200R1 結合,選擇性轉染myc-β4GalT1、wtCD200R1 和N44Q 突變體,LPS 處理后收集各組培養上清液,ELISA 檢測顯示,iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 炎性細胞因子的表達受到抑制,而轉染N44Q 突變體則促進炎性細胞因子的表達（圖5）。表明CD200Fc-CD200R1 抑制炎性細胞因子的釋放,此過程有CD200R1 的N-糖基化44號位的參與,β4GalT1 對CD200R1 糖基化修飾抑制炎性因子的釋放。

圖5 在CD200-CD200R1 體系中N44Q 促進BV2 炎癥活化

2.6 N44Q 突變促進神經元損傷 為進一步研究CD200R1 的N-糖基化修飾對BV2 細胞活化后釋放神經毒性的影響,在BV2 細胞中轉染myc-β4GalT1、wtCD200R1 及N44Q 突變體,LPS（100 ng/mL）刺激后加入神經元,采用LDH 試劑盒檢測神經元損傷情況。在上述各野生型組和突變組BV2 細胞中加入神經元,結果顯示加入anti-CD200 抗體后,野生型組神經元損傷增加。在突變組加入神經元共培養后,進一步加入anti-CD200 抗體后,神經元損傷無明顯變化（圖6）。

圖6 N44Q 突變對神經元損傷的影響

3 討論

當機體處于正常狀態時,小膠質細胞維持靜息狀態,當處于疾病狀態時,小膠質細胞被誘導活化,通過分泌IL-1β、TNF-α、TGF-β 等細胞因子促進小膠質細胞吞噬破碎細胞和變性髓鞘,對機體有益[8]。但當機體免疫狀態異常時,小膠質細胞持續活化并分泌細胞因子和氧自由基,促使神經元損傷[9]。因此,小膠質細胞在中樞神經系統炎癥中發揮雙相作用。

β4GalT1 是研究最廣泛的一種糖基轉移酶,分為長型和短型兩種,短型β4GalT1 與β-1,4-半乳糖苷鍵（Galβ1-4GlcNAc）的形成有關。本文研究短型β4GalT1,免疫共沉淀實驗發現β4GalT1 和CD200R1存在相互作用,且參與調節CD200R1 的N-糖基化。CD200R1 廣泛表達于包括小膠質細胞在內的髓系細胞表面,CD200 則廣泛表達于神經元、內皮細胞、淋巴細胞等。研究表明,阻斷CD200-CD200R1 結合能增強中樞神經系統中小膠質細胞的炎性活化和神經元損傷[6]。本課題組前期研究發現CD200R1 存在N 糖基化修飾,且44 號位糖基化扮演重要角色[7]。本文結果顯示,CD200R1 的44號位點N-糖基化修飾對CD200-CD200R 的結合十分重要,去除該位點的N-糖基化將削弱CD200R1 與CD200 的結合。在LPS 誘導的小膠質細胞炎癥活化模型中,發現使用抗CD200 抗體阻斷CD200 與CD200R 結合,可上調炎癥因子的表達,去除CD200R1 的44 號位點N-糖基化也呈現相似的效應,同時增強對神經元的損傷。本研究通過選擇性調節小膠質細胞的過度活化,為中樞神經系統炎癥性疾病提供潛在藥物設計和治療靶點。