ARMC8在胃癌細(xì)胞惡性進(jìn)展中的機(jī)制研究

陳夢(mèng)閣，田 霞，占 婷，劉維潔，黃曉東

1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科（武漢 430071）

2.武漢市第三醫(yī)院（武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院）消化內(nèi)科（武漢 430060）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種起源于胃上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率在全世界所有類(lèi)型癌癥中排列第五，僅次于肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌，同時(shí)也是癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因[1]。目前中晚期GC 患者首選的治療方法仍是手術(shù)切除，盡管現(xiàn)在GC 的手術(shù)方法和策略取得了很大進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍不理想，術(shù)后局部區(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率仍較高，且與腫瘤分期呈正相關(guān)[2-3]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是GC 有效治療的主要障礙，嚴(yán)重影響GC 患者的預(yù)后。因此，探究GC 進(jìn)展的相關(guān)分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善GC 患者預(yù)后、降低死亡率非常重要。

ARMC8（armadillo repeat containing protein 8）是犰狳重序列蛋白家族（ARMCs）的一員，是一種在脊椎動(dòng)物中高度保守的犰狳蛋白質(zhì)[4]。ARMC8 參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，包括細(xì)胞遷移、增殖、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生等[5]。目前越來(lái)越多關(guān)于ARMC8 的研究集中在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面[6-10]。研究表明ARMC8 在卵巢癌和結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期TNM 分期及不良預(yù)后顯著相關(guān)，敲低ARMC8 表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的遷移能力，但其調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未闡明[7,10]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，ARMC8 在骨肉瘤細(xì)胞、膀胱癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展中都顯示出與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切關(guān)聯(lián)[11-13]。EMT 是上皮細(xì)胞重新分化為間充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，已被證實(shí)與GC 的轉(zhuǎn)移、侵襲、化療抵抗等密切相關(guān)[14]。因此，抑制細(xì)胞進(jìn)入EMT期或逆轉(zhuǎn)EMT 期至間充質(zhì)到上皮轉(zhuǎn)化可作為腫瘤控制和預(yù)防的有效策略[15]。然而，ARMC8 在GC中的表達(dá)以及是否參與調(diào)節(jié)EMT 尚未報(bào)道。

本研究旨在了解ARMC8 在GC 組織、血漿及細(xì)胞中的表達(dá)情況，觀察ARMC8 對(duì)GC 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探索ARMC8 是否調(diào)控EMT 及其調(diào)控機(jī)制，以期為GC 進(jìn)展中的分子機(jī)制研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 GC組織數(shù)據(jù)分析

采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GC 組織和正常組織在ARMC8 的表達(dá)水平上進(jìn)行差異分析，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括408 個(gè)GC 樣本和211 個(gè)正常樣本。

1.2 臨床樣本收集

收集GC 患者血漿22 例、健康人血漿20 例。GC 血漿來(lái)源于武漢市第三醫(yī)院組織活檢確診為GC 的患者，所有病人均未行放、化療。以同期健康體檢者作為對(duì)照組。血漿標(biāo)本均在空腹采血后2 h 內(nèi)經(jīng)4℃ 1 600 g 離心10 min，提取上層血漿后立即置于-80℃保存。本研究經(jīng)武漢市第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-013）。

1.3 細(xì)胞系

正常人胃黏膜GES-1 細(xì)胞和人GC 細(xì)胞株，包括HGC-27 和AGS，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞型培養(yǎng)庫(kù)（中國(guó)上海）提供。GES-1 細(xì)胞在高糖DMEM中培養(yǎng)，HGC-27 細(xì)胞在RPMI-1640 中培養(yǎng)，AGS 細(xì)胞在Ham's F-12K 中培養(yǎng)，均補(bǔ)充10%胎牛血清、1%的青-鏈霉素，細(xì)胞在37℃含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、Ham's F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、轉(zhuǎn)染用OPTIMEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；ARMC8、GAPDH 引物、siRNA 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自銳博（廣州）公司；RNA 提取試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（貨號(hào)：11668019） 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)膠（貨號(hào)：356234）購(gòu)自美國(guó)BD 公司。BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。抗GAPDH 的小鼠單克隆抗體（貨號(hào)：ab8245）、抗snail 的兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab216347）、抗N-catenin 的小鼠單克隆抗體（貨號(hào)：ab98952）、抗E-catenin 的小鼠單克隆抗體（貨號(hào)：ab238099）、抗β-catenin 的兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab32572）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗cyclin D1 的兔抗體（貨號(hào)：#55506）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；c-myc 抗體（貨號(hào)：sc-42）購(gòu)自美國(guó)ABclonal 公司；ARMC8 抗體（貨號(hào)：12653-1-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；羊抗鼠IgG（貨號(hào)：E-AB-1001）和羊抗兔IgG（貨號(hào)：E-AB-1003）均購(gòu)自中國(guó)Elabscience 公司；熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀（BIO-RAD）購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本 OLYMPUS 公司。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27 和AGS 細(xì)胞于6孔板中鋪板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)70%，根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑使用說(shuō)明，將敲除ARMC8基因的siRNA（si-ARMC8 組）及陰性對(duì)照siRNA（NC 組）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h 后提取總RNA，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，以確保觀察到的生物學(xué)變化是由靶基因的表達(dá)引起的。si-ARMC8 及NC siRNA 的序列如下：

si-ARMC8-1

正向：5’-CGGACAGAUGAUAACUGUATT-3’

反向：5’-UACAGUUAUCAUCUGUCCGTT-3’

si-ARMC8-2

正向：5’-GCACUGAAAUGUUUCUCAGTT-3’

反向：5’-CUGAGAAACAUUUCAGUGCTT-3’

si-ARMC8-3

正向：5’-GAGCAAAUGAUGAAGACAUTT-3’

反向：5’-AUGUCUUCAUCAUUUGCUCTT-3’

NC siRNA

正向：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

反向：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 qRT-PCR檢測(cè)

參照TRIzol 試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞的總RNA。采用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 純度和濃度。將質(zhì)量合格的總RNA 與逆轉(zhuǎn)錄試劑及特異性的ARMC8 逆轉(zhuǎn)錄引物（GAPDH 作為內(nèi)參）混合，反應(yīng)體系如下：1 ug RNA，1ul 特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物，EnzymeMix 1ul，5×Reaction buffer 4 ul，用無(wú)RNA 酶水補(bǔ)足至20 ul，在20 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 15 min，100℃ 5 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后取1.33 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 與1 μL 引物混合，在20 μL 反應(yīng)體系中，95℃變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為對(duì)照，用2-△△Ct法檢測(cè)ARMC8 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：

ARMC8：

正向：5’-TCGATGACCCTGGTAAATG-3’

反向：5’-CTGTCCGAATTGCTCCA-5’

GAPDH：

正向：5’-GGGGCTCTCCAGAACATC-3’

反向：5’-TGACACGTTGGCAGTGG-3’

1.6.2 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

利用RIPA 裂解液（質(zhì)量濃度為10 g/L 的PMSF）裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA 蛋白分析試劑盒根據(jù)使用說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)分子量大小，用約10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離并將其電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用抗ARMC8、GAPDH（1 ∶ 10 000 稀釋?zhuān)豢箂nail、E-cadherin、N-cadherin、c-myc、cyclin D1 （1 ∶ 1 000 稀釋?zhuān)┘唉?catenin （1 ∶ 5 000 稀釋?zhuān)┑囊豢?℃孵育過(guò)夜。TBST 緩沖液洗滌3 次后，室溫孵育二抗（1 ∶ 3 000稀釋?zhuān)? h，洗滌后經(jīng)ECL 底物顯色顯影，成像儀掃描結(jié)果。

1.6.3 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

使用孔徑為8 μm 的24 孔Transwell 室進(jìn)行。將Matrigel 原液置于冰箱內(nèi)4℃冰浴過(guò)夜，用預(yù)冷的槍頭使其混勻；用融化的Matrigel 原液和預(yù)冷無(wú)血清的培養(yǎng)液配制Transwell 上室凝膠液，以每孔50 μL 包被Transwell 上室，37℃放置2 h 使其成膠。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并將3×105細(xì)胞置于100 ul 無(wú)血清培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至上層基質(zhì)室，下室添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑，每組設(shè)置3 個(gè)副孔。培養(yǎng)48 h 后，取出小室并用PBS 清洗2 遍，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染液染色。在顯微鏡200 倍鏡下隨機(jī)選擇高倍視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)入侵細(xì)胞的數(shù)量。

1.6.4 傷口愈合實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27 和AGS 細(xì)胞鋪板，置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，直至融合率達(dá)70%。按照si-ARMC8 使用說(shuō)明轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至融合率達(dá)100%。使用1 mL 槍頭沿直尺在細(xì)胞單層上劃兩條平行線(xiàn)，用PBS 沖洗三次，去除細(xì)胞碎片，然后再加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在0 h 、12 h、24 h 用倒置光學(xué)顯微鏡拍攝圖像。圖片使用ImageJ 軟件量化原始劃痕內(nèi)遷移細(xì)胞覆蓋的剝落距離百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。插圖數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism進(jìn)行。計(jì)量資料用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARMC8在GC組織、血漿及GC細(xì)胞系中的表達(dá)情況

根據(jù)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，評(píng)估了408 例GC 組織和211 例胃正常組織的mRNA 表達(dá)譜。使用基因差異分析ARMC8 表達(dá)水平的差異（圖1A）。結(jié)果顯示，與正常組織相比，GC 組織中ARMC8 的表達(dá)顯著上調(diào)。此外，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)了ARMC8 在GC 患者血漿及細(xì)胞系中的表達(dá)。相較于健康對(duì)照人群，GC 患者血漿中ARMC8 表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖1B）。與正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）相比，ARMC8 的表達(dá)在GC 細(xì)胞系HGC-27（P ＜0.05）和AGS（P ＜0.001）中均上調(diào)（圖1C），進(jìn)一步的WB 結(jié)果與qRT-PCR 結(jié)果相一致，觀察到一條代表ARMC8 的75.5kDa 蛋白條帶在兩種GC 細(xì)胞系和正常胃黏膜細(xì)胞系中的表達(dá)有差異（圖1D）。

圖1 ARMC8在GC組織、GC患者血漿及GC細(xì)胞系中的表達(dá)情況Figure 1.Expression of ARMC8 in GC tissues,the plasma of GC patients and GC cell lines

2.2 GC細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

對(duì)HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)si-ARMC8 組與NC 組ARMC8 的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示si-ARMC8 組的ARMC8 表達(dá)水平均低于NC 組（P ＜0.05）（圖2）。

圖2 HGC-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-ARMC8后ARMC8的表達(dá)情況Figure 2.Eexpression of ARMC8 in HGC-27 cells after transfecting si-ARMC8

2.3 GC細(xì)胞的侵襲與遷移能力

使用傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。與NC 組相比，si-ARMC8 組中的GC 細(xì)胞在12 h、24 h 內(nèi)傷口愈合率明顯更低（P ＜0.05）（圖3）；si-ARMC8組侵入Matrigel 的癌細(xì)胞數(shù)量明顯少于NC 組（P＜0.001）（圖4）。

圖3 下調(diào)ARMC8后GC細(xì)胞的遷移能力Figure 3.The migration ability of gastric cancer cells after downregulating ARMC8

圖4 下調(diào)ARMC8后GC細(xì)胞的侵襲能力Figure 4.The invasion ability of GC cells after downregulating ARMC8

2.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路和EMT

用ARMC8 siRNA 轉(zhuǎn)染后，HGC-27 和AGS細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin 上調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin 下調(diào)。研究還檢測(cè)了EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子snail 的蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)抑制ARMC8表達(dá)后，snail 的表達(dá)受到抑制（圖5A）。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明ARMC8 在GC 進(jìn)展中起重要作用，且與EMT 過(guò)程密切相關(guān)。研究表明，EMT 的過(guò)程不僅受轉(zhuǎn)錄因子如slug，snail，ZEB1 和twist的調(diào)節(jié)，還受某些信號(hào)通路的控制，包括TGF-β/smad 和Wnt/β-catenin 等[16-17]。為檢測(cè)GC 細(xì)胞中ARMC8 調(diào)節(jié)EMT 的機(jī)制，通過(guò)WB 驗(yàn)證ARMC8是否能激活或抑制Wnt/β-catenin 途徑。結(jié)果表明，與NC 組相比，下調(diào)ARMC8 可抑制β-catenin、c-myc、cyclinD1 的表達(dá)（圖5B）。上述結(jié)果表明，下調(diào)ARMC8 可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)抑制GC 細(xì)胞的EMT。

圖5 下調(diào)ARMC8后EMT抑制和Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活情況Figure 5.The EMT suppression and activation of Wnt/β-catenin signaling pathway after downregulating ARMC8

3 討論

ARMC8 是一種新型的犰狳重序列蛋白，研究表明ARMC8 是CTLH 復(fù)合物的關(guān)鍵成分之一，與PI3 激酶、Wnt、TGF-β 和NF-κB 途徑的基本生物學(xué)過(guò)程和功能有關(guān)，參與調(diào)節(jié)增殖、存活、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞粘附、遷移和其他活動(dòng)[18]。越來(lái)越多的與ARMC8 相關(guān)的研究集中于腫瘤的發(fā)生發(fā)展方向，特別是腫瘤轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道，ARMC8已被發(fā)現(xiàn)在許多癌癥中表達(dá)上調(diào)，如非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等[6-9,19]，并與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良顯著相關(guān)，乃至被認(rèn)為是預(yù)后標(biāo)志物或潛在的有效治療靶點(diǎn)。本研究表明，與正常胃黏膜組織相比，ARMC8 在GC 組織中表達(dá)明顯升高，并在GC 患者血漿及GC 細(xì)胞系中檢測(cè)到ARMC8 的高表達(dá)水平。然而，ARMC8 在GC 中的作用和機(jī)制尚不明確。

本研究進(jìn)行了一些細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ARMC8對(duì)GC 的影響，結(jié)果表明，ARMC8 是人GC 中的一個(gè)促癌基因，其表達(dá)與GC 細(xì)胞的侵襲和遷移能力呈正相關(guān)。用si-ARMC8 轉(zhuǎn)染GC 細(xì)胞后，其遷移、侵襲能力都有所抑制。因此，認(rèn)為ARMC8 具有促進(jìn)GC 細(xì)胞惡性行為的能力。

有研究表明，ARMC8 在癌細(xì)胞的EMT 中起著重要作用，如 ARMC8 的沉默可以抑制骨肉瘤細(xì)胞[11]及膀胱癌細(xì)胞[12]EMT 的發(fā)生，而促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌EMT 的發(fā)生[13]。此外，多項(xiàng)研究表明ARMC8 可以通過(guò)經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的EMT[11-13]。典型的Wnt 信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵組成部分是β-catenin。Wnt 信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)β-catenin 的核易位，這不僅啟動(dòng)了下游基因轉(zhuǎn)錄的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括cyclinD1，c-myc 和MMP，還增加了EMT 調(diào)節(jié)因子snail 和vimentin在癌細(xì)胞中的表達(dá)[20-21]。在膀胱癌[12]及骨肉瘤細(xì)胞[11]中，ARMC8 沉默抑制癌細(xì)胞EMT 進(jìn)展及β-catenin、cyclinD1 和c-myc 的表達(dá)。ARMC8 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 通路和EMT 來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展[13]。通過(guò)ARMC8 對(duì)GC細(xì)胞EMT 過(guò)程的影響，結(jié)果顯示抑制ARMC8 的表達(dá)后，GC 細(xì)胞中E-cadherin 的表達(dá)增加，而N-cadherin 以及EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子snail 則相反。因此，下調(diào)ARMC8 的表達(dá)抑制了GC 的EMT 過(guò)程。此外，本研究還觀察到下調(diào)ARMC8 抑制了GC 細(xì)胞中β-catenin、cyclinD1 和c-myc 的表達(dá)。因此，認(rèn)為ARMC8 可能通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)了GC 細(xì)胞的EMT。

綜上，ARMC8 在GC 組織、血漿及細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，抑制ARMC8 的表達(dá)可抑制GC 細(xì)胞的侵襲和遷移能力，說(shuō)明ARMC8 可通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT 從而促進(jìn)GC 的惡性進(jìn)展，基于ARMC8/Wnt/β-catenin 軸的生物或藥物干預(yù)GC 的EMT 過(guò)程可能是一種有潛力的GC 治療新策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。