長鏈非編碼RNA NORAD在肺癌中的表達及其對肺癌細胞增殖能力的影響

王靖，楊利杰，宋政，王瑞宇，張鈺璐，李俊

1.大理大學臨床醫學院，云南 大理 671000；

2.大理大學第一附屬醫院心胸外科，云南 大理 671000；

3.大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)主要包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)和微小RNA(miRNAs)。LncRNAs是一種長度超過200個核苷酸的ncRNA，主要位于細胞核或者細胞質中[1]，其表達與細胞生長、發育、腫瘤發生及進展等多種細胞生物學過程關系密切[2]。LncRNAs可通過競爭內源性RNA(ceRNAs)的方式，作為miRNA“分子海綿”來抑制miRNA 介導的靶標mRNA 的降解[3-4]。例如，LncRNA LCAT1 可作為ceRNA，通過“海綿化”miR-4715-5p 上調Ras 相關C3 肉毒菌素物底物1(ras-related C3 botulinum toxin，Rac1)活性，進而促進肺癌的進展[5]。LncRNA DRAIC在肺癌中的表達顯著升高，與患者的預后密切相關，其可通過抑制miR-223-3p的表達，促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲[6]。LncRNA可作為肺癌的診斷標志物及候選治療靶點[7]。

LncRNA DNA損傷誘導的非編碼RNA(NORAD)也稱為LINC00657，位于chr20:34636726-34636747，主要存在于細胞質中，在多種腫瘤的表達均顯著升高[8]。NORAD 可通過miRNA-455/CDK14 軸影響肺癌細胞的增殖能力[8]。但NORAD 與肺癌細胞增殖的深入調控機制，尚不明確。課題組前期通過高通量測序篩選發現，包括LncRNA NORAD 在內的多種LncRNA 的表達顯著上調[9]。本研究在前期研究的基礎之上，研究NORAD 在肺癌中的表達及其與細胞增殖的關系，初步明確NORAD在肺癌中的可能調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 肺癌細胞(A549、HCC827、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1650)購自于賽百慷(上海)生物技術股份有限公司，HFL1(人胚肺成纖維細胞)購自于武漢靈思生物技術有限公司，由本實驗室保存。Annexin V FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8 試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司，免疫熒光檢測試劑盒購自于武漢靈思生物有限公司，qRT-PCR 檢測試劑盒購自于美國Bio-Rad 公司，Lipofectamine 3000轉染試劑盒購自于美國Invitrogen公 司，Anti-Bad antibody、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-Cleaved Caspase-3 antibody、Anti-Ki-67 antibody 購自于英國Abcam 公司；Anti-GAPDH antibody 購自于武漢三鷹生物技術有限公司。hsa-miR-26b-5p mimics、hsa-miR-654-5p mimics、及NC (Negative control)購自于廣州銳博生物，si-NORAD (5'-AAGCCACCUUUGTGAACAGUA-3')購自于上海吉瑪制藥技術有限公司。qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。10 對肺癌患者腫瘤及配對的癌旁組織均為2019 年1月至2021 年12 月在我院心胸外科住院，行肺手術后經病理檢查明確診斷為肺癌患者。患者年齡44～76 歲，平均年齡55 歲，其中男性4 例，女性6 例。腫瘤及其配對的癌旁樣本置于液氮中保存。每例患者均已簽署知情同意書，由我院倫理委員會審查和批準。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers of qRT-PCR

1.2 主要儀器 HERAcell 150i1型CO2培養箱購自于美國Thermo 公司；Lightcycler480 型qRT-PCR 儀購自于美國Roche公司；NIKON DS-U3正置熒光顯微鏡購自于日本尼康；Multiskan Sky 全波長酶標儀購自于美國Thermo公司；FACS Calibur 流式細胞儀購自于美國BD 公司；PowerPace Basic 型電泳儀購自于美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺癌組織樣本RNA-seq分析 取6個肺癌組織及配對的癌旁組織樣本經過RNA 抽提、純化、建庫之后，基于Illumina HiSeq2500 測序平臺，對這些文庫進行雙末端(paired-end，PE)測序，篩選差異表達基因(篩選標準：|log2FoldChange|＞1，P＜0.05)。

1.3.2 NORAD互做miRNA生物信息學分析 利用在線分析軟件Starbase (https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、Jefferson (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)、miRDB (http://mirdb.org/)及miRNA 測序數據聯合分析NORAD可能互做miRNA。

1.3.3 細胞復蘇及培養 細胞復蘇后，A549 及HFL1 細胞利用Ham's F-12K 加10% 胎牛血清培養，HCC827、NCI-H1299、NCI-H1395 及NCI-H1650 細胞利用RPMI-1640 加10%胎牛血清培養；另所有細胞培養基中均增加1%青霉素-鏈霉素雙抗培養。所有細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞聯合度達到80%～90%時，按照1∶(2～3)的比例傳代，備用。

1.3.4 qRT-PCR檢測NORAD及hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p表達 TRIzol裂解法提取肺癌組織及細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測NORAD、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p 的表達。數據以2-△△CT表示，△CT=目的基因Ct值-內參基因Ct 值，△△CT=實驗組[Ct (目的基因)-Ct (內參基因)]-對照組[Ct(目的基因)-Ct(內參基因)]。

1.3.5 免疫熒光檢測肺癌組織中Ki-67表達 肺癌及配對的癌旁組織樣本經冰凍切片，室溫晾干水分，4%多聚甲醛固定10 min，置于磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min。抗原修復后，5%BSA 抗原阻斷，滴加Ki-67 抗體(1∶300)，4℃孵育過夜；PBS 清洗3 次，每次5 min，滴加Cy3標記的二抗，37℃孵育60 min，PBS清洗3次，每次3 min，滴加抗熒光淬滅封片劑。利用日本尼康正置熒光顯微鏡(NIKON DS-U3)采集照片。利用Image-pro plus6.0 分析軟件計算每個樣本中Ki-67 的平均熒光值。

1.3.6 細胞分組及轉染 取對數生長期的A549細胞，1×104cells/mL的細胞量傳于細胞培養6孔板，將A549 細胞隨機分為空白對照組(Control)、si-NORAD組、miR-654-5p mimics 組、miR-26b-5p mimics 組、si-NORAD與miR-654-5p mimics聯合組、si-NORAD與miR-26b-5p mimics 聯合組。si-NORAD、miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 按照Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒說明書轉染入A549細胞，24 h后收集細胞對應檢測。

1.3.7 EdU 檢測細胞增殖 將37℃預熱的EdU工作液(20 μmol/L)加入6孔板，37℃、5%CO2繼續培養2 h 后，去除培養基，PBS 清洗細胞3 次，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min，每孔用1 mL 細胞通透液(含0.3%Triton X-100 的PBS)，室溫孵育10～15 min，PBS清洗細胞3次后，每孔加入5 μL 碘化丙啶(PI)染色，熒光顯微鏡拍照。

1.3.8 細胞凋亡檢測 收集細胞，按照試劑盒操作說明，預冷乙醇固定后，加入10 μL Annexin V-FITC及PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨后置于冰浴中，上機檢測，FlowJo Dongle分析軟件進行分析。

1.3.9 熒光素酶檢測 將包含NORAD 與miR-26b-5p、miR-654-5p 結合位點的野生型(Wt)及突變型(Mut)序列的pmiGLO載體分別與miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 或NC 片段傳染A549 細胞，24 h后收集細胞，利用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素的表達。

1.3.10 Western blot 檢測 A549 細胞利用RIPA裂解，冰上孵育20 min后，4℃、14 000×g離心3～5 min，取上清液，BCA 定量，每孔按照20 μg 蛋白量上樣，SDS-PAGE電泳后，轉膜，分別以兔抗Ki-67(1∶800)、Bad(1∶800)、Bcl-2(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶800)及GAPDH(1∶10 000)，4℃、孵育過夜后，TBST 漂洗3次，加入HRP酶標抗兔二抗。加入ECL 發光液膜置于全自動化學發光分析儀中掃描，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.4 統計學方法 所有實驗均重復三次，計量數據以均數±標準差(±s)表示。實驗數據采用GraphPad Prism6.0統計分析及繪圖。多組間數據的比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，組織標本中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達采用配對t 檢驗，利用線性回歸分析肺癌組織中NORAD 與Ki-67、miR-26b-5p及miR-654-5p與Ki-67及NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA NORAD 在肺癌中的表達及其與Ki-67 表達的相關性 RNA-seq 分析發現，與癌旁組織比較，NORAD 在肺癌組織中的表達顯著升高(log2FoldChange=6.455，P=0.000)。qRT-PCR 檢 測 分析，與癌旁組織比較，肺癌組織中NORAD的表達顯著上調(t=6.430，P=0.000)；qRT-PCR 檢測發現，與HFL1細胞比較，肺癌細胞中NORAD 的表達顯著上調(F=46.910，P=0.000)。免疫熒光檢測發現，與癌旁組織相比，肺癌組織中Ki-67 的表達顯著升高(t=9.100，P=0.000)；線性回歸分析，肺癌組織中NORAD的表達與Ki-67的表達呈正相關(r=0.646，P=0.000)，見圖1。

圖1 NORAD在肺癌中的表達及其與Ki-67表達的相關性Figure 1 Expression of NORAD in lung cancer and its correlation with Ki-67 expression

2.2 肺癌中NORAD 互做miRNA 篩選及其在肺癌中的表達水平 利用在線分析軟件Starbase、Jefferson、miRDB 及miRNA 測序數據聯合分析NORAD 可能互做miRNA，結果發現，miR-26b-5p、miR-654-5p為NORAD 候選互做miRNA。RNA-seq 分析發現，miR-26b-5p、miR-654-5p 在肺癌組織中的表達顯著降 低(log2FoldChange 分 別 為-3.654、-2.165，均P=0.000)，qRT-PCR 檢測發現，與癌旁組織相比，肺癌組織 中miR-26b-5p (t=6.821，P=0.000)與miR-654-5p(t=4.075，P=0.000)的表達顯著下調；與HFL1 細胞比較，肺癌細胞中miR-26b-5p (F=41.890，P=0.000)與miR-654-5p (F=39.260，P=0.000)的表達顯著下調(F=32.010，P=0.000)。直線回歸分析結果顯示，肺癌組織 中miR-26b-5p (r=-0.403，P=0.000)與miR-654-5p(r=-0.423，P=0.000)的表達與Ki-67 的表達呈負相關，見圖2。

圖2 肺癌中NORAD互做miRNA篩選及其在肺癌中的表達水平Figure 2 Screening and expression analysis of NORAD bound miRNA in lung cancer Screening of NORAD interacting miRNA in lung cancerand its expression level in lung cancer

2.3 肺癌中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達的相關性 經直線回歸分析結果顯示，肺癌組織中，NORAD 與miR-26b-5p (r=-0.435，P=0.023)、miR-654-5p(r=-0.395，P=0.041)的表達呈負相關。熒光素酶檢測分析發現，miR-26b-5p mimics(t=14.270，P=0.000)、miR-654-5p mimics (t=13.310，P=0.000)與野生型NORAD 載體(Wt)共轉染后，熒光素酶的表達顯著降低；而miR-26b-5p mimics (t=1.670，P=0.170)、miR-654-5p mimics (t=13.310，P=0.000)與 突 變 型NORAD載體(Mut)共轉染后，熒光素酶的表達無顯著變化，見圖3。

圖3 肺癌中NORAD與miR-26b-5p、miR-654-5p表達的相關性Figure 3 Correlation analysis of NORAD expression with miR-26b-5p and miR-654-5p in lung cancer

2.4 NORAD對肺癌細胞增殖及凋亡的影響 與Control組比較，抑制NORAD(si-NORAD)后，A549 細胞的增殖能力顯著降低；過表達miR-26b-5p、miR-654-5p 后，A549 細胞的增殖能力顯著降低；與si-NORAD 組比較，同時抑制NORAD 及過表達過表達miR-26b-5p、miR-654-5p 后，A549 細胞的增殖能力進一步降低。與Control 組比較，抑制NORAD 后，A549 細胞的凋亡比例顯著增加(t=10.250，P=0.000)；過表達miR-26b-5p (t=18.56，P=0.000)、miR-654-5p(t=10.030，P=0.000) 后，細 胞 凋 亡 顯 著 升 高；與si-NORAD 組比較，同時抑制NORAD 及過表達miR-26b-5p(t=7.960，P=0.001)、miR-654-5p(t=3.704，P=0.020)后，A549細胞的凋亡進一步升高，見圖4。

2.5 NORAD抑制后肺癌細胞中凋亡相關蛋白表達的變化 經Western blot 檢測，與Control 組比較，si-NORAD 后，A549 細胞中Bad (t=9.498，P=0.000)、Cleaved caspase-3 (t=6.715，P=0.000)相對表達量均顯著升高，而Bcl-2 的相對表達量顯著降低(t=6.102，P=0.003)；miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics得到類似的結果。si-NORAD 與miR-654-5p mimics、miR-26b-5p mimics 聯合后，與si-NORAD 組比較，A549 細 胞 中Bad (t=3.374、5.715，P=0.025、0.005)、Cleaved caspase-3 (t=4.680、6.425，P=0.033、0.000)相對表達量進一步升高，而Bcl-2 的相對表達量顯著降低(t=2.946、6.153，P=0.042、0.00)，見圖5 和表2。

圖5 Western blot檢測肺癌細胞凋亡相關蛋白表達Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in lung cancer cells detected by Western blot

表2 凋亡相關蛋白的相對表達量(±s，n=3)Table 2 Relative expression of apoptosis-related proteins(±s,n=3)

表2 凋亡相關蛋白的相對表達量(±s，n=3)Table 2 Relative expression of apoptosis-related proteins(±s,n=3)

注：與Control組比較，aP＜0.01；與si-NORAD組比較，bP＜0.05；與si-NORAD組比較，cP＜0.01。Note:Compared with the Control group,aP＜0.01;Compared with si-NORAD group,bP＜0.05;Compared with si-NORAD group,cP＜0.01.

組別Control組miR-654-5p mimics組miR-26b-5p mimics組si-NORAD組si-NORAD+miR-654-5p mimics組si-NORAD+miR-26b-5p mimics組Cleaved Caspase-3 0.344±0.030 0.442±0.013a 0.516±0.017a 0.577±0.017a 0.649±0.019b 0.710±0.038c Bad 0.339±0.018 0.435±0.023a 0.521±0.021a 0.606±0.024a 0.711±0.027b 0.796±0.019c Bcl-2 0.5456±0.027 0.467±0.015a 0.429±0.019a 0.372±0.015a 0.311±0.013b 0.247±0.004c

3 討論

肺癌(lung cancer)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均排在惡性腫瘤前列[10]，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理表型，約占85%[11]。由于缺乏及時、有效的診斷方法，患者確診時已處于中晚期，與早期NSCLC相比，中晚期NSCLC 的治療反應性降低且預后差，導致NSCLC患者死亡率較高，5 年生存率約為15%[12]。近年研究認為，LncRNA 作為致癌基因或抑癌基因在腫瘤進展的過程中發揮著至關重要的作用，可調控腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、侵襲和轉移等惡性行為，是腫瘤潛在的診斷和治療靶點[13-15]。本研究發現，在肺癌組織及人肺癌細胞株中，NORAD 的表達均顯著升高，暗示其與肺癌的發生及發展的關系密切。

LncRNAs作為miRNA“分子海綿”，發揮競爭內源性RNA(ceRNAs)的功能來抑制miRNA 介導的靶標mRNA 的表達、調節細胞的增殖等行為[3-4]。LncRNA SNHG12 在肺癌中的表達顯著升高，可通過調節miR-320a/β-catenin軸抑制肺癌細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡[16]。肺癌組織中LncRNA HOXA-AS3的表達水平升高，而miR-340-5p 的表達水平降低，抑制HOXA-AS3表達可顯著抑制細胞增殖，細胞凋亡顯著增加，并增強DMS114/DDP 細胞順鉑敏感性，其作用機制可能與miR-340-5p 的表達上調有關[17]。LncRNA DANCR 在肺癌中的表達顯著升高，促進DANCR的表達，可顯著促進肺癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡，其機制可能通過抑制miR-216a的表達所致[18]。課題組通過RNA-seq 檢測分析發現，NORAD 在肺癌組織中的表達顯著升高，抑制NORAD 的表達可顯著抑制肺癌細胞增殖，增加細胞凋亡。利用在線分析軟件Starbase、Jefferson、miRDB 及miRNA測序數據聯合分析miR-26b-5p、miR-654-5p 為NORAD 候 選 互 做miRNA。miR-26b-5p、miR-654-5p 在肺癌組織中的表達顯著降低，促進miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達，可顯著抑制肺癌細胞增殖。以上結果暗示NORAD可能通過抑制miR-26b-5p、miR-654-5p的表達而影響肺癌細胞增殖。

研究證實，miRNA 主要通過與靶基因的3'-UTR結合后，抑制靶基因的表達而調控細胞的增殖、分化、凋亡等行為，參與腫瘤的發生及進展，可作為多種腫瘤的診斷及治療靶點[19]。miRNA-146b-5p在肺癌組織中的表達顯著升高，其可能通過上調線皮素-1(LAD-1)的表達來促進細胞增殖，進而促進肺癌進展[20]。miR-520f和miR-143-3p在肺癌患者中表達降低，且與肺癌細胞增殖和侵襲行為以及肺癌患者的不良預后有關[21]。本研究通過RNA-seq 分析發現，miR-26b-5p、miR-654-5p在肺癌中的表達顯著降低，與肺癌細胞增殖關系密切。研究發現，在肺癌患者組織及血清中，miR-26b-5p 的表達顯著降低，肺癌細胞分泌包含miR-26b-5p的外泌體，調節肺癌放療敏感性[22]。在結直腸癌中，miR-654-5p 的表達顯著降低，導致HAX-1的表達上調，進而促進細胞增殖、侵襲及轉移[23]。最近研究報道，包括LncRNA、環狀RNA(circRNA)等均可作為miRNA的“分子海綿”，影響miRNA的表達[3-4，24]。通過研究發現，NORAD可作為miR-26b-5p、miR-654-5p的“分子海綿”，抑制NORAD 及促進miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達，可顯著抑制肺癌細胞增殖。但miR-26b-5p、miR-654-5p 通過調控下游何種基因及通路而影響肺癌細胞增殖的，還需深入探討。

綜上所述，肺癌中NORAD的表達顯著上調，可能通過抑制miR-26b-5p、miR-654-5p 的表達而促進肺癌細胞增殖，NORAD 可作為肺癌的診斷標志物。但由于本項目主要集中在細胞水平研究，后期擬通過動物水平進一步明確NORAD 與肺癌細胞增殖的關系；同時，miR-26b-5p、miR-654-5p 所調控的靶基因及下游通路尚需進一步明確。