蛋白互作研究方法在水稻中的應用及主要互作數據庫匯總

陳麗娟　劉西西　羅金金　陳明花　匡瑜　田志宏　張健

摘要：實驗設計時選擇合適的方法，有利提高科研效率。綜述了多種研究蛋白質相互作用的方法，分析了各類方法的優缺點以及在水稻中的研究應用，歸納整理了現有的大型蛋白互作數據庫。

關鍵詞：水稻；蛋白質的相互作用；互作方法；互作數據庫

中圖分類號：Q753? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）01-0082-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.01.019

Application of Protein Interaction Research Methods in Rice Genetic Engineering and Summary of Large Interaction Network Database

CHEN Lijuan 1， LIU Xixi 2， LUO Jinjin 2， 3， CHEN Minghua 3， KUANG Yu 3， TIAN Zhihong 1， ZHANG Jian 2， 3

（1. College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou Hubei 434025， China; 2. China National Rice Research Institute，

Hangzhou Zhejiang 311400， China; 3. State Key Laboratory of Rice Biology， Hangzhou Zhejiang 311400， China;

4. Bureau of Agriculture and Rural Affairs of Liling， Zhuzhou Hunan 412205， China）

Abstract： Studying the interaction between proteins is very important for rice genetic improvement， disease resistance and yield increase， and improving rice quality. This paper introduces a variety of methods for studying protein-protein interaction， analyzes the advantages and disadvantages of various methods， as well as their research and application in rice. The existing large protein interaction database was summarized for reference by researchers.

Key words： Rice; Protein-protein interaction; Interaction method; Interaction database

蛋白質是各種基本功能的主要完成者，蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction）幾乎參與所有細胞生命活動的進程，從分子層面研究細胞均離不開對互作蛋白的鑒定和功能解析。蛋白質是生命活動的承擔者，大部分蛋白質主要通過相互作用或形成蛋白復合物來行使功能。水稻作為重要的模式生物，通過檢測蛋白質之間的相互作用來探索其生長發育分子機制，以改善水稻品質。隨著蛋白組學的發展，蛋白互作技術日新月異，了解檢測各種蛋白互作技術方法的優缺點，在實驗設計時選擇合適的方法，能大大提高科研效率。

1? ?蛋白質相互作用的研究方法及其在水稻中的應用

在水稻中篩選蛋白質互作的試驗方法眾多，主要可以分為兩個大類，即活體內試驗（in vivo）和生物活體外試驗（in vitro）［1? ］。

1.1? ?活體內試驗

體內試驗能真實地反應生物體內的蛋白互作情況，所以目前開發的方法多為體內試驗，主要包括酵母雙雜交、分裂泛素系統、細菌雙雜交、雙分子熒光互補、免疫共沉淀、鄰近標記、表面等離子共振技術、噬菌體展示技術、熒光共振能量轉移技術等方法。

1.1.1? ? 酵母雙雜交（Yeast two hybrid， Y2H）? ? 酵母雙雜交信號檢測在酵母細胞內進行，在一定程度上代表了體內真實的蛋白互作，因此Y2H是目前識別和研究蛋白質與蛋白質相互作用的最簡便、最快速、最經濟和最直接的方法之一。在篩選蛋白質互作時，只需轉入酵母菌株，無須蛋白抽提、純化等復雜步驟，方便快捷。但Y2H技術也存在一定局限，當蛋白質本身已經具有轉錄活性，不需要與另外的蛋白結合就能激活下游的效應基因表達時，會導致結果出現假陽性。在生物化學實驗中，想要證實酵母雙雜交篩選到的互作是否可靠，往往還需要其他方法的驗證結果作為補充證據。使用Y2H技術篩選蛋白質互作組已經在人類、小鼠、果蠅、秀麗隱桿線蟲、擬南芥、瘧原蟲、病毒、鷓鴣、非洲爪蟾等多個物種中得到了廣泛應用［2 - 9 ］。如Liu等［10 ］利用Y2H技術對水稻中10個SAPKs（應激活化蛋白激酶）和9個bZIP轉錄因子（受脫落酸ABA信號誘導）進行了蛋白互作組分析，最終鑒定到14個陽性互作，為ABA調控水稻的機制提供了新的思路。

1.1.2? ? 分裂泛素系統（Split-ubiquitin system， Split- Ub）? ? 傳統的Y2H技術在研究膜蛋白的相互作用存在局限性，于是以Y2H為基礎的衍生系統-分裂泛素系統應運而生。Split-Ub系統對泛素進行了截斷，因此被稱為分裂泛素系統。傳統的Y2H要求誘餌蛋白能穩定地表達為融合蛋白，所檢測的融合蛋白要轉運于親水性的核基質中，而對于細胞質蛋白和細胞膜蛋白，一旦離開特定的疏水環境，其結構會變得極不穩定，正常結構不穩定會阻礙與其他蛋白質的相互作用，Split-Ub系統則彌補了缺陷，被廣泛用于檢測膜蛋白之間的互作［11 ］。作為Y2H系統的衍生系統，此系統也有相似的局限性，實驗結果也存在假陽性和假陰性。乙烯激素對水稻生長發育有多方面的調控作用，Ma等［12 ］利用分裂泛素膜蛋白等互作實驗發現，EIN2（乙烯信號轉導調節因子）與MHZ3（內質網基糖化膜蛋白）存在蛋白互作，水稻突變體中，MHZ3減弱了乙烯誘導的OsEIN2積累，而過表達MHZ3則提高了OsEIN2蛋白的豐度，表明OsEIN2跨膜結構域在水稻乙烯信號轉導中的重要性。

1.1.3? ? 細菌雙雜交（Bacterial two-hybrid， B2H）? ? 細菌雙雜交是一種利用大腸桿菌研究蛋白互作的方法［13 ］，與Y2H系統相比，B2H系統具有以下幾個優點：使用的大腸桿菌生長周期短；質粒轉化效率高，不易污染；適用范圍廣，可用于傳統酵母雙雜交不能運用的范圍，如膜蛋白的相互作用等。但B2H系統中的蛋白質缺乏翻譯后修飾，會導致其部分功能缺失影響蛋白質的相互作用。該系統與Y2H系統也存在相似的局限性，特異性不強、靈敏度不高、難以實現高通量、實驗結果容易出現假陰性和假陽性。在水稻中，僅有的嘗試為武漢大學使用紅蓮型水稻雜種F1幼穗構建了其細菌雙雜交文庫［14 ］，但使用B2H技術來驗證水稻中的蛋白互作還未見報道。

1.1.4? ? 雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation， BiFC）? ? BiFC技術的基本原理是選擇某些不保守的氨基酸位點，將熒光蛋白多肽鏈剪切成不能發熒光的N端和C端兩個多肽片段，這兩個蛋白片段在細胞內共表達或者體外再次接近時不能自發組裝成完整的、具有活性的熒光蛋白［15 ］。BiFC技術能在活細胞中檢測到一些較弱的或瞬時的蛋白相互作用，且能夠通過共聚焦顯微鏡等儀器直觀看到熒光信號。但BiFC技術系統對溫度敏感，最佳溫度為30 ℃，在高溫條件下，片段之間不易互補形成完整的熒光蛋白，溫度越高越不利于片段之間的互補，嚴格的溫度控制對BiFC技術在正常生理條件下研究活體細胞的蛋白互作的應用有一定限制。Chu等［16 ］通過BiFC等試驗，鑒定了KLP（激酶樣蛋白）與LPA1（控制松散株型）在水稻細胞核中的相互作用；WCR1（負調控水稻堊白）和MT2b（金屬硫蛋白）的相互作用通過雙分子熒光互補（BiFC）等實驗得到證實，揭示了水稻株型與堊白的部分分子調控機制［17 ］。伴隨高新技術的發展，由傳統BiFC技術衍生出的多色熒光互補技術［18 ］，能夠可視化同一細胞中的多種蛋白質相互作用，為研究植物復雜的調控網絡提供了一個有用的新工具［19 ］。

1.1.5? ?免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）

免疫共沉淀是利用抗原蛋白和抗體蛋白質之間的特異結合，來檢測完整細胞內蛋白質之間的互作［20 ］。這種實驗方法可保留蛋白最原始翻譯后修飾的狀態，避免了人為操作影響。但此技術有要求抗體特異、實驗操作步驟繁雜和篩選到的互作蛋白可能為間接互作等缺點，導致其不適用于高通量蛋白的相互作用篩選。在實驗中洗脫混合物的過程可能包含一些非特異結合的蛋白，所以實驗檢測到的互作蛋白往往需要其他實驗方法進行二次驗證。前人在水稻中的研究發現，OsCBM1（麥芽糖素樣結構域蛋白）可通過多種植物激素和非生物脅迫處理顯著刺激，Co-IP實驗證明，OsCBM1與特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子OsRacGEF1發生蛋白相互作用，并參與NADPH氧化酶介導的ROS酶產生，促進了水稻的干旱耐受性［21 ］。

1.1.6? ? 鄰近標記（Proximity labeling， PL）? ? PL技術是近年在生命科學領域新發展起來的技術，其原理是將一個具有鄰近標記功能的酶與目標蛋白融合，通過酶催化的共價修飾將鄰近的蛋白標記上生物素，最后通過親和素磁珠富集生物素標記蛋白進行質譜鑒定［22 ］。PL技術特別的地方在于鑒定蛋白互作時對蛋白質的結構無穩定要求，檢測靈敏度也不依賴于蛋白互作的強度，因此能檢測一些傳統方法檢測不了的弱互作。相比Y2H系統篩選互作蛋白，臨近標記技術無須構建文庫，更方便快捷；能檢測Y2H系統檢測不了的膜蛋白互作。PL技術還能與其他技術交叉聯用，能在時空上動態地監測活細胞內的蛋白互作。Lin等［23 ］利用PL技術在水稻原生質體中建立了鄰近依賴性生物素鑒定系統；還使用該系統在水稻體內發現了多個與OsFD2（水稻營養生長相關蛋白質）互作的蛋白。

1.1.7? ? 其他方法? ? 上述生物活體內研究蛋白質互作的方法都已在水稻中被普遍使用，除此之外，表面等離子共振技術（Surface plasmon resonance， SPR）、噬菌體展示技術（Phage display technology， PDT）、熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer， FRET）等高新技術檢測方法雖尚未應用于水稻蛋白互作研究，但在其他生命科學領域早已有相關研究報道。

表面等離子共振技術只需少量樣品，且無須純化蛋白、標記蛋白，就能在天然條件下實時動態檢測蛋白之間發生相互作用的過程，因此在醫療抗體—抗原分子相互作用的研究上比傳統驗證互作的技術展現出了一定優勢。等離子共振技術檢測互作目前在水稻中還未有報道，但在醫學抗體抗原上有重要應用［24 ］。噬菌體展示技術可應用于蛋白質相互作用篩庫，史密斯因為發明了噬菌體展示技術在2018年獲得了諾貝爾化學獎［25 ］。使用噬菌體展示技術能快速篩選結合蛋白的短肽，該技術對于藥物開發和抗體篩選極為重要［26 ］，第一個獲得美國食品藥品監督管理局批準的PD-L1抗體（免疫療法抗腫瘤）就是使用噬菌體展示技術篩選得到的。同時通過該技術篩選到的抗體可以直接用于活細胞、活體組織，甚至體內實驗。由于該技術不涉及蛋白純化等過程，避免了蛋白質變性的可能。熒光共振能量轉移技術能夠在活細胞的正常生理條件下進行檢測［27 ］，并具有靈敏度高、操作簡便和實驗周期短的優勢，在研究蛋白質相互作用過程中得到了廣泛的應用，但是在實驗中需要給檢測蛋白加上標記，并且對熒光光譜要求也較高，所以不適用于大批量檢測互作蛋白。

1.2? ?生物活體外試驗

1.2.1? ? 融合蛋白沉降（Pull down）? ? ?融合蛋白沉降又稱體外蛋白質結合，原理是用谷胱甘肽親和樹脂固化目標蛋白標簽的融合蛋白，當混合溶液過柱時，目標蛋白標簽上的融合蛋白可以“捕捉”與其有相互作用的蛋白［28 ］。該方法運用較為廣泛，與Y2H系統相比，特異性更強，能排除一部分的假陽性。但是也存在一定局限，不能模擬體內蛋白的真實情況、需要純化蛋白等繁雜操作、不適用于大規模高通量篩選蛋白互作等。Lu等［29 ］發現敲除基因OsMFS1后，水稻的花粉和胚囊都在生殖階段流產，通過Pull down等實驗發現OsMFS1可以與減數分裂同源配對蛋白OsHOP2發生蛋白相互作用，形成穩定的復合物，由此證明OsMFS1在水稻花藥和胚囊的正常發育中發揮著重要作用。

1.2.2? ?親和純化結合SWATH（AP-SWATH）? ? 親和純化作為SWATH的衍生技術，能夠高特異性的準確富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白，并實現復合蛋白質的準確鑒定和定量［30 ］。與傳統方法相比，AP-SWATHd的優點在于能定量分析且靈敏度更高、通量更大、質譜技術能一次性檢測2 000種蛋白、3次重復之間差異極小，重復性高。該技術在水稻中僅有的應用僅有1例，Zhang等［31 ］使用AP-SWATH技術共定量了1 872個獨特的蛋白質，根據萌發4個階段的羰基化強度，對主要參與維持活性氧水平、脫落酸和種子儲備的66個羰基化蛋白進行了進一步分析，揭示了種子萌發過程中羰基化蛋白的動態變化規律。

1.3? ?蛋白互作研究方法小結

各個方法與技術都有一些共性和差異性。例如，酵母雙雜交、分裂泛素系統和細菌雙雜交都是通過直接與靶蛋白互作的方式來驗證蛋白是否互作，融合蛋白沉降、免疫共沉淀和串聯親和層析檢測到的可能是間接互作。酵母雙雜交、分裂泛素系統、細菌雙雜交、融合蛋白沉降主要是在體外驗證蛋白質互作并不能反應生物體內的真實情況，而免疫共沉淀、雙分子熒光互補則是在生理條件下反應蛋白質的互作。從目前來看，單個研究蛋白互作的方法都具有一定的局限性，例如使用酵母雙雜交技術時需要費時費力地構建cDNA文庫，且不適用于鑒定轉錄因子的互作蛋白；而免疫共沉淀技術只適用于檢測高親和力的互作蛋白，對于弱的或瞬時的相互作用分析效率較低等?？偟膩碚f，單一的研究方法并不能真實反映蛋白質互作情況，需要多個研究方法和技術相結合才更具有說服力。

2? ?蛋白互作網絡數據庫（protein-protein interaction database）

隨著高通量時代的來臨，驗證單個互作蛋白已經不能滿足科研人員的需求，使用上述技術在家族、庫與庫之間篩選互作蛋白互作組構建蛋白互作網絡逐漸成為趨勢。蛋白互作網絡是單個蛋白質通過與其他蛋白彼此互作串聯組成的系統網絡參與生命活動的多個環節，主要包括體內信號傳導、轉錄水平調控和正常機體代謝等；結構化地分析蛋白質之間的相互作用，深入蛋白質在生物系統中的作用機制；了解疾病等特殊生理條件下生物信號轉導與能量代謝的相互作用機制，這些研究對未來生物化學發展具有重要意義。通過蛋白互作研究方法構建互作網絡搭建互作數據庫，借助于蛋白互作檢測和質譜技術，迄今已有多種物種的蛋白互作組被鑒定，也常被用于兩個家族之間的互作研究，如Singh等［32 ］運用互作技術在MAPKK-MAPK中篩到了20組互作數據。

蛋白互作組學在基因組、蛋白組等組學技術發展應用的基礎上，成為目前生物技術的研究方向和熱點，除實驗驗證互作外，還可通過查詢數據庫來挖掘互作信息。前人通過生物信息技術整合數據構建了部分蛋白質相互作用數據庫，但數據庫的相對數量還處于發展階段，且物種主要集中在模式生物——哺乳動物以人類為代表，植物物種中以擬南芥為代表。數據庫中的互作組信息主要來自于已發表的期刊文獻，大多為零散的蛋白互作驗證，極少數為大規模酵母雙雜交篩庫以及測序技術驗證，互作數據通量不高。除了實驗技術驗證兩個蛋白之間是否發生互作，還可以根據家族、同源、結構來進行預測，查詢前人整理的蛋白互作數據庫，利用這些數據結合生物信息學技術可以預測水稻中部分蛋白之間的互作，此種方法互作數據通量高，速度快，但準確性不高。蛋白互作數據庫中可以查詢到蛋白質的來源物種、蛋白質具體的序列與注釋、互作蛋白的數據來源（文獻報道或智能預測）、使用的實驗技術等。STRING作為全球最大的蛋白互作數據庫［33 ］，目前的最新版本中包含了14 094個生物體，67 592 464種蛋白，共20 052 394 042個相互作用的信息。該數據庫包含了從已發表的文獻中挖掘出的實驗結果、從其他互作蛋白數據庫中提取的數據、基于生物信息學預測的互作數據3個部分。但STRING中數據大多來源于人機交互預測，互作信息的準確性可能會大打折扣。除STRING數據庫外，還存在一些公共蛋白互作數據庫。我們歸納整理了庫容量可觀且能正常搜索使用的蛋白互作數據庫（表1），利用這些數據庫結合生信技術預測互作蛋白組，可以在一定程度上提高科研效率。

3? ?展望

在水稻生物學研究中，目前還尚未出現大型的水稻蛋白互作數據庫。但近年來，蛋白互作組學已經被廣泛運用于生命科學的其他多個領域，和多個學科之間產生交叉，相信在不遠的將來，蛋白質互作組學的研究可能會填補關于水稻互作組學數據庫的空白。在公共蛋白互作數據的基礎上，互作數據庫未來可能會朝向通量高、靈敏度高、準確率高、可重復性高、物種范圍更廣的蛋白質組學研究領域上發展。蛋白質組學研究方法結合基因組學、合成生物學、生物信息學等鄰近學科交叉，多種技術并存，齊頭并進，共同發展，利用自己的優勢互補局限，推動更多高新技術的發展。多學科交叉互相發展為將來的蛋白質組學提供了新的思路，并有望在水稻蛋白質組學領域產生更重大的發現。

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收稿日期：2022 - 04 - 15；修訂日期：2022 - 11 - 25

基金項目：浙江省自然科學基金重點項目（LZ21C130001）。

作者簡介：陳麗娟（1995 — ），女，云南曲靖人，碩士研究生在讀，研究方向為植物分子生物學與基因工程。Email：chenlijuan0723@163.com。

通信作者：張? ??。?979 — ），男，湖南寧遠人，研究員，博士生導師，研究方向為水稻生殖性狀的遺傳基礎解析和育種利用。Email： zhangjian@caas.cn。