高效陰離子離子色譜-脈沖安培法測定食品中透明質酸鈉含量

朱鴻達，張松艷，陳自猷

(泉州海關綜合技術服務中心，福建 泉州 362000)

0 引言

透明質酸(hyaluronic acid, HA)，又名玻璃酸、玻尿酸，是一種以d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖胺為雙糖單位交替連接而成的直鏈線性陰離子粘多糖。HA 最早是由美國科學家從牛眼玻璃體中分離得到，因其具有良好的潤滑性、保濕性和黏彈性，并具有極佳的生物相容性[1-4]。我國于2008 年批準透明質酸鈉為新資源食品，使用范圍為保健食品原料。2021 年1 月7 日，國家衛健委正式批準透明質酸鈉(即透明質酸、玻尿酸)為新食品原料，可在普通食品中添加使用，目前為止我國還沒有針對食品中透明質酸鈉檢測方法和標準[5-6]。由于透明質酸本身溶解性較差，在使用時常將其轉化為鈉鹽，即透明質酸鈉(sodium hyaluronate, SH)。SH 是一種白色粉末狀固體，有時也呈纖維狀，具有較好的保濕性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有機溶劑，無臭味，是一種鏈狀的天然高分子多糖類物質，目前已被廣泛應用于多個領域[7-10]，因此建立其準確定量分析方法具有重要意義。

目前，測定透明質酸鈉含量的方法有：硫酸-咔唑法、CTAB 濁度法、凝膠色譜法、elson-morgan 法、免疫法、共振瑞利散射法等[11-16]。硫酸-咔唑法是用強酸將透明質酸鈉降解成葡糖醛酸，葡糖醛酸與咔唑反應形成有機絡合物并顯示特有的紫色，其吸光度和糖醛酸的濃度成正比，通過葡萄糖醛酸的含量來確定透明質酸鈉的含量。CTAB 濁度法測定發酵液中透明質酸鈉的含量是利用HA 可同(CTAB)等陽離子表面活性劑發生絡合反應，產生混濁現象，并在一定濃度范圍內遵循朗伯-比爾定律，但該方法的缺點是不適合實時檢測。利用凝膠色譜法測定透明質酸鈉含量，該方法操作復雜，分析速度慢，價格昂貴，對人員操作水平要求高。此外，調查發現，目前常用的SH 含量測定方法主要是通過降解后顯色，結合可見-紫外分光光度計，根據吸光度測定其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量，進而推算SH 的含量。這種方法操作比較復雜，條件苛刻，顯色劑的引入干擾測定的準確度[17-19]。本文用硼砂作催化劑對透明質酸鈉用硫酸進行酸解，將葡萄糖醛酸分離出來。利用高效陰離子離子色譜-脈沖安培法測定葡萄糖醛酸的含量，通過折算系數，確定透明質酸鈉的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS5000+ 離子色譜儀(美國DIONEX)：配脈沖安培檢測器；XS205DU 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Vortex-6 旋渦混合器(蘇州江東精密儀器有限公司)；MONET-HH-4 電熱恒溫水浴鍋(上海沐奈實業有限公司)；FS1000Y-3 高速粉碎機(昆明雷邁機械設備有限公司)；氫氧化鈉(上海國藥集團)；醋酸鈉(滬試)；硼酸(滬試)；硫酸(滬試)；葡萄糖醛酸標準品(LMAI Bio)：純度≥98%。

1.2 試驗方法

色譜條件：糖分析柱：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)， 保 護 柱：CarboPac PA20 Guard (3 mm×30 mm，6.5 μm)；淋洗 液：A：NaOH (0.15 mol/L)-NaOAc(0.10 mol/L)+2%乙腈等度洗脫，體積流量：1.0 mL/min；進樣體積：25 μL；檢測器：脈沖安培檢測器，金電極。

1.3 溶液的配置

標準儲備液：精確稱取20 mg 葡萄糖醛酸標準品，置于100 mL 容量瓶種，加水溶解并定容至刻度，搖勻備用。

標準工作液：根據需要移取適量標準儲備液，用水稀釋定容，配制濃度分別為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L/、20 mg/L 和50 mg/L 的標準工作液，該溶液臨用前現配。

0.025 mol/L 硼砂硫酸液：稱取4.77 g 硼砂溶于500 mL 濃硫酸(優級純)中，保存于密封的玻璃瓶。

1.4 樣品處理

準確稱取粉碎后的樣品1.0 g(精確至0.001 g)至25 mL 離心管中，加入超純水充分溶解并定容至刻度。準確移取上述溶液1 mL 至5 mL 離心管中，置冰浴中冷卻在不斷振搖下緩緩滴加入3 mL，0.025 mol/L硼砂硫酸液，用渦旋混合器充分混勻。將其置于沸水加熱10 min(每隔5min 振搖一次)，冷卻至室溫。將上述酸解液轉移至100 mL 容量瓶中，用純水定容。經濾紙過濾，濾液備用，同時做空白樣。

2 檢測分析

2.1 色譜分離

對巧克力、牛奶等樣品進行酸解后，借鑒中性單糖的離子色譜分析方法，考慮到羧基對酸性單糖在陰離子分析柱上的洗脫，采用NaOH-NaOAc 體系淋洗液進行等度洗脫，在流動相中添加適量有機溶解(2%乙腈)，可以抑制菌類的生長，還可以減少有機雜質在色譜柱上的保留，從而延長色譜柱的使用壽命[5]。實驗結果表明：此方法快速有效，在10 min 內可較好實現葡萄糖醛酸和中性單糖及其他酸性糖的分離。

2.2 結果計算與表述

由線性方程計算葡萄糖醛酸的含量，透明質酸鈉含量按式(1)計算：

式中：X為樣品中透明質酸鈉的含量(mg/kg)；C為從標準工作曲線上查得的對應葡萄糖醛酸的質量濃度(mg/L) ；2.067 5 為透明質酸鈉重復雙糖單元質量(401.3)與葡萄糖醛酸相對分子質量的比值(194.1)；V為試樣溶液定容體積(mL)；m為試樣溶液所代表的質量(g)。

2.3 精密度與準確度

按照試驗方法，對巧克力、飲料樣品進行低、中、高3 個濃度的加標回收試驗，每個濃度水平測定5 次，計算回收率和RSD。試驗結果表明，該方法回收率在86.0%～120.0%，RSD 在1.5%～4.0% 之間，證明該方法精密度和準確度較高。

表1 精密度和加標回收試驗(n=5)

2.4 標準曲線、檢出限與定量限

對一空白樣品連續平行測定11 次，檢出限按公式LOD=3×σ/S(其中σ為空白標準偏差，S為校正曲線斜率)計算，并以3 倍檢出限，作為定量限[7-9]。結果為：當線性范圍為1～50 mg/L，線性回歸方程：Y=0.022 1X-0.000 7，R2=0.999 6。檢出限為3.2 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 色譜條件優化

3.1 淋洗液的選擇

對巧克力、飲料等樣品進行酸解后，色譜柱采用CarboPac PA20 Guard(3 mm×30 mm，6.5 μm)。采用3 種不同體系淋洗液進行等度洗脫(淋洗液1：含0.15 mol/L 的NaOH 和0.10 mol/L 的NaOAc 的 水溶液；淋洗液2：含0.15 mol/L 的NaOH 的水溶液；淋洗液3：含0.4 mol/L NaH2PO4的水溶液)，在流動相中添加適量有機溶解(2% 乙腈)。在其他色譜條件完全相同情況下，3 種不同體系淋洗液實驗結果表明：采用淋洗液1 洗脫具有比其他淋洗液更好的分離效果，分離度如表2 所示。

表2 各樣品的葡萄糖醛酸峰與相鄰色譜峰的分離度

3.2 色譜柱選擇

色譜柱分別采用色譜柱1：CarboPac PA1 Analytical Column (4 mm×250 mm))和 色 譜 柱2：Dionex CarboPac PA10，色譜柱3：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)。其余實驗條件相同。實驗結果：色譜柱1、色譜柱2 和色譜柱3 均具有較好的分離度，但色譜柱3 分離效果最佳。各色譜柱的分離度如表3 所示。

表3 3 種色譜柱的葡萄糖醛酸峰與相鄰色譜峰的分離度

4 結果與討論

(1)本文建立一種基于高效陰離子色譜-脈沖安培法對食品中透明質酸鈉含量的快速測定新方法，此方法快速有效，可在10 min 內完成檢測。采用糖分析柱：Dionex CarboPac PA20 Analytical (3 mm×150 mm，6.5 μm)，淋 洗 液：A：NaOH(0.15 mol/L)-NaOAc(0.10 mol/L)+2% 乙腈等度洗脫，在質量濃度為1～50 mg/L 內具有良好的線性關系，R2=0.999 6，檢出限為3.2 μg/kg，定量限為10 μg/kg。采用此方法對巧克力、飲料樣品進行加標回收試驗，回收率均在86.0%～120%，RSD 在1.5%～3.9%之間，證明該方法精密度和準確度較高，能滿足食品中透明質酸檢測分析要求。

(2)在流動相中添加適量有機溶解(如2%乙腈)，不僅可以抑制菌類的生長，減少有機雜質在色譜柱上的保留，從而延長色譜柱的使用壽命。對某些分析，流動相中加入適量的有機溶劑還可以達到一定的效果。某些離子在添加有機溶劑后保留時間有很大的變化，這樣可以將原本無機鹽體系無法分析的離子加以分離。