基于多指標綜合評分法優選茅莓根水提工藝?

黃貴發，王瑜婷，鐘 霞，余欣彤，徐東婷，邱彩月，陳江平

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

茅莓根為薔薇科懸鉤子屬植物茅莓Rubus parvifolliusL.的干燥根，又名紅梅消、大暑莓、蛇泡簕、烏泡根，為民間常用中草藥，資源豐富，主產于廣東、山東、河南、廣西等地，具有清熱解毒、祛風利濕、活血涼血的功效，用于感冒發熱、咽喉腫痛、風濕痹痛、濕熱黃疸、熱毒瀉痢等癥［1-5］。茅莓根收載于1977 年版《中華人民共和國藥典》一部，之后各版均未記載，茅莓根為2020 年版《中華人民共和國藥典》一部成方制劑鼻咽靈片和鼻咽清毒顆粒的主要組成之一［6］。現代研究表明，茅莓根的化學成分主要有黃酮、二萜、三萜及三萜皂苷類成分，其中黃酮類成分表兒茶素具有保肝、抗癌、抗氧化的藥理作用［7-10］。目前，國內外對茅莓根的研究較少，主要集中在藥材化學成分和質量控制方面，鮮見茅莓根制劑相關研究報道［11-12］。本研究以水為提取溶劑，采用煎煮法提取，以浸泡時間、加水量、煎煮次數和煎煮時間4個因素設計L9（34）正交試驗，以干膏得率和表兒茶素含量為質量評價指標，權重系數分別設為0.7、0.3進行綜合評價，篩選出最佳水提工藝，為茅莓根相關制劑的進一步開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統（德國Merck公司）；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TC-15 型套式恒溫器（海寧市新華醫療器械廠）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；YRE-501 型旋轉蒸發器、SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵、DLSB-5L/20 型低溫冷卻液循環泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）。

1.2 試劑與試藥表兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110878-200102）；甲醇（德國Merck 公司，色譜純）；N，N-二甲基甲酰胺（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；水為超純水，其他試劑為分析純；茅莓根藥材（批號：Y200601）產地為廣東，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合《廣東省中藥材標準（第三冊）》茅莓根項下相關要求［1］。

2 方法與結果

2.1 水提液制備取茅莓根飲片適量，分成9份，每份約100 g，按正交試驗設計進行回流提取，濾過，分別合并每組試驗的水提液，減壓濃縮，定容至50 mL，得樣品濃縮液。

2.2 干膏得率測定精密吸取茅莓根水提液25 mL，置已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，于105 ℃烘箱內干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，干膏得率計算公式：

2.3 表兒茶素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為：（0.04 mol/L枸櫞酸溶液-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）-甲醇=98∶2；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取表兒茶素對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇制成每1 mL含表兒茶素0.05 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取樣品濃縮液2 mL 至50 mL 量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇定容至50 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑適量，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。表兒茶素對照品溶液在33 min左右出峰，供試品溶液在相應時間有峰與之對應，而空白溶劑在33 min 左右無峰，表明其對表兒茶素的測定無干擾，該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.5 線性關系考察 精密稱取表兒茶素對照品7.522 mg，加50%甲醇定容至25 mL，制成濃度為300.88 μg/mL的表兒茶素對照品母液，分別取0.5、1、2、5、8、10 mL對照品母液置10 mL量瓶中，用50%甲醇定容到刻度，得一系列對照品溶液，濃度 分 別 為15.044、30.088、60.176、150.440、240.704、300.88 μg/mL，按上述色譜條件進樣測定，以對照品溶液濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得表兒茶素回歸方程為Y=8972.9095X-12390.3725（r2=0.9998），說明表兒茶素在15.044～300.88 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.6 精密度考察 取“2.3.5”項下濃度為60.176 μg/mL 的對照品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.37%，說明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性考察 取同一樣品濃縮液，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.76%，說明該方法重復性良好。

2.3.8 穩定性考察 取同一供試品溶液，于制備0、2、4、8、12、24 h 后按上述色譜條件進樣測定，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.79%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.9 加樣回收試驗 取已知含量的樣品濃縮液適量，精密吸取9 份，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分為3 組，分別按高、中、低濃度精密加入表兒茶素對照品溶液適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率為101.7%，RSD 為2.57%，說明該方法準確度良好，見表1。

表1 表兒茶素加樣回收率試驗結果（n=9）

2.4 水提工藝優化

2.4.1 正交試驗 采用L9（34）正交試驗優選茅莓根水提工藝。以干膏得率和表兒茶素含量為質量評價指標，結合前期單因素考察的試驗結果，選取浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）和煎煮次數（D）為考察對象，因素水平設計見表2。

表2 因素水平設計

2.4.2 數據處理 多指標試驗綜合加權評分法是將試驗結果進行歸一化處理后，根據各項評價指標在整個試驗中的重要性，設定不同權重進行評分的一種方法，在保證分析指標較為全面的同時，對于關鍵影響因素又給予了相應側重，使結果分析更加全面、科學、合理［13-16］。本研究將各項指標的結果通過歸一化處理后，設定干膏得率和表兒茶素含量的權重系數分別為0.7、0.3，得到綜合評分，歸一化值=（指標值-指標最小值）/（指標最大值-指標最小值）［17-19］；綜合評分=干膏得率歸一化值×70%+表兒茶素歸一化值×30%。見表3—4。

表3 茅莓根水提工藝正交直觀分析

表4 茅莓根水提工藝正交方差分析

由直觀分析得出，影響因素D＞C＞B＞A，即煎煮次數＞煎煮時間＞加水量＞浸泡時間，其中，A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，最優組合為A2B3C2D3；方差分析表明煎煮次數（D）對試驗結果有顯著影響（P＜0.05），浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）3 個因素對試驗結果無顯著影響（P＞0.05），在實際生產中，從節約自然資源、提高生產效率等方面考慮，確定最佳水提工藝為A1B2C1D3，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次0.5 h。

2.4.3 驗證試驗 稱取茅莓根飲片3 份，每份約100 g，按優選的水提工藝進行回流提取，結果表明，驗證試驗各指標的RSD均小于2%，說明優選的茅莓根水提工藝穩定可行。見表5。

表5 驗證試驗結果（n=3）

3 討論

本研究在表兒茶素HPLC 含量測定方法的建立過程中，對不同廠家和型號的色譜柱（Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBRIDGE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm））進行考察，分別比較了各色譜柱的出峰時間、峰型、分離度以及適用性，最終確定YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為本研究方法的色譜柱；在進行流動相比例的選擇時，曾采用甲醇-0.01 mol/L 枸櫞酸（20∶80）進行測定［20］，分離效果差，后參考兒茶中表兒茶素含量測定方法［6］，加入一定比例N，N-二甲基甲酰胺，采用甲醇-（0.04 mol/L 枸櫞酸-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）比例分別為（5∶95）（3∶97）（2∶98）等進行測定，最后選定（2∶98）比例，在此條件下表兒茶素的分離效果和出峰時間均較好。

本研究以干膏得率結合表兒茶素含量，并采用綜合評分法結合正交設計優選出茅莓根的水提工藝。文獻表明，茅莓根中還含有大量三萜及皂苷類成分［7］，僅以表兒茶素含量作為優選水提工藝的質量指標略有不足，因此，在后續研究中，可將表兒茶素含量結合三萜及皂苷類成分含量作為質量指標進行綜合評價，從而更客觀反映水提工藝的優劣，為茅莓根的相關制劑研究提供依據。