基于網絡藥理學方法分析柴胡配伍香附治療癲癇的作用機制?

呂婷婷，藍紹航，李瑞暖，秦紅玲，刁麗梅△

1 廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530000； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530000

癲癇是以腦神經元異常放電為特征的慢性反復發作性短暫腦功能失調綜合征［1］。目前全球約有7千萬癲癇患者，我國癲癇患病率約為3.6‰～7.0‰，活動性癲癇患者數量達900 多萬，而且每年以40 萬的數量遞增［2］。癲癇反復發作，治療時間長，不僅給患者身體、心理帶來傷害，也給患者家庭增加了經濟負擔，給社會、國家追求國民健康的目標帶來了更大挑戰［3］。因此，研究癲癇的有效治療方法成為目前亟需解決的醫學和社會任務。

柴胡歸肝、膽經，善于疏肝解郁；香附歸肝、脾、三焦經，善于理氣疏肝，香附能助柴胡解肝經之郁滯，促進柴胡行氣活血之效。柴胡、香附常用于治療癲癇，但兩者的化學成分較多，而且兩者治療癲癇的分子機制尚不明確，因此，本研究采用網絡藥理學方法，分析柴胡配伍香附治療癲癇的潛在作用機制，為后期研發及治療癲癇提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 柴胡、香附有效成分及作用靶點中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是獨特的中草藥系統藥理平臺，其由在《中華人民共和國藥典》中注冊的499 味中草藥組成，包含29384 個成分、3311 個靶標和837種相關疾病，是針對每個化合物成分提供較為全面的人體吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程的評估數據，通過該數據庫可獲取藥物、靶標和疾病之間的關系。通過TCMSP 數據庫（http：//Tcmspw.com/tcmsp.php）檢索“柴胡、香附”，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服劑量未改變藥物到達體循環的百分比，藥物相似性（drug-likeness，DL）是藥物設計中使用的一個定性概念，用于評估化合物的“藥物樣”程度，這有助于優化藥代動力學和藥物特性，因而設置滿足條件：OB＞30%，DL＞0.18，下載符合條件的有效成分，同時查找有效成分靶點，將無ADME信息的化合物從最終名單中刪除。最后通過Uniprot 數據庫（http：//www.pharmgb.org/）將預測出的靶點蛋白名轉換為基因名。

1.2 疾病相關基因篩選人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）是人類基因綜合數據庫，可提供簡明基因組、蛋白質組、遺傳和功能方面已知和預測的人類基因。利用GeneCards數據庫（http：//www.Genecards.org/）、在線孟德爾人類遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.OMIM.org/）篩選“seizure disorder”基因，以獲得相對完善的基因數據。

1.3 篩選靶基因使用R語言軟件“VennDiagram”包，將癲癇相關基因分別與柴胡、香附作用靶點取交集，獲得柴胡、香附作用于癲癇的靶基因，并繪制韋恩圖。

1.4 中藥有效成分與靶基因的關系通過自編程的Perl 腳本選出與靶基因相關的有效成分，同時利用Cytoscape 軟件構建柴胡、香附有效成分與癲癇靶基因關系圖。

1.5 關鍵基因的蛋白-蛋白相互作用網絡(proteinprotein interactions，PPl)STRING數據庫是一個可以檢索已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用的數據庫，為了更好體現靶基因表達蛋白間的關系，通過STRING 數據庫在滿足綜合得分≥0.4的條件下建立PPI網絡。

1.6 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）采用GO 和途徑富集分析靶基因，可揭示其所參與的細胞成分、分子功能、生物過程及信號通路，便于理解中藥有效成分作用于疾病的潛在機制。Bioconductor 是一個基于R語言的、面向基因組信息分析的應用軟件集合，可運用于DNA 微陣列或基因芯片數據處理、分析、注釋等。利用Bioconductor 中的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”3 個功能對靶基因進行GO 和KEGG富集分析，GO分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組成(cellular component，CC)。

2 結果

2.1 柴胡、香附有效成分及其作用靶點在TCMSP數據庫中篩選出柴胡有效成分179個，作用靶點1704 個，香附有效成分104 個，作用靶點689個，通過自編程的Perl 腳本將作用靶點轉換為基因文本，獲得柴胡677 個有效、獨立的靶基因，香附289個有效、獨立的靶基因。

2.2 疾病相關基因與靶基因共獲得10293個與癲癇相關、獨立有效的基因。利用R 語言軟件“VennDiagram”包將10293 個與癲癇相關的基因分別與677個柴胡作用靶點、289個香附作用靶點取交集，共獲得39 個靶基因，即為柴胡配伍香附治療癲癇的靶基因，見表1及圖1。

圖1 癲癇與柴胡、香附作用靶點的交集

表1 靶基因的重要通路

2.3 有效成分與靶基因關系網絡圖有效成分-靶基因關系網絡見圖2。

圖2 柴胡-香附的“成分-核心靶點-通路”網絡模型

2.4 靶基因PPl網絡共篩選出ESR1、AR、NCOA1、NCOA2、NR3C1等30個重要靶基因，即為柴胡配伍香附治療癲癇的重要作用靶點，見圖3—4。

圖3 柴胡配伍香附治療癲癇的靶基因PPI網絡

圖4 關系較為密切的前30個靶基因

2.5 GO 和KEGG 富集分析靶基因的GO 功能主要涉及細胞因子受體結合、DNA 結合轉錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異等；KEGG 信號通路主要富集在神經活性配體-受體相互作用、雌激素信號通路、膽堿能突觸、乳腺癌、前列腺癌，通路上CHRM2、GABRA1、PRSS1、CHRM3、CHRM1、ADRA1A、NR3C1、CHRNA2、GRIA2、ADRA2C、TRPV1、CHRM4等相關基因較為重要。見圖5—6。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

3 討論

癲癇主要是由大腦神經反復、過度同步化放電導致發作性、突然短暫性的腦功能失調、紊亂［4］，是一種毀滅性的神經疾病，發病率、致殘率和死亡率較高［5］。目前西醫治療癲癇主要包括藥物治療、手術治療等，但存在藥物副作用大、術后復發率高等缺點；中醫治療癲癇歷史悠久、經驗獨特。本研究通過探討柴胡配伍香附治療癲癇的有效靶點和信號通路，為中醫藥治療癲癇提供新思路。根據癲癇發作的臨床特征，將其歸于中醫“癇證”范疇，研究治療癲癇的方劑發現柴胡和香附配伍能夠有效治療癲癇發作。

中醫稱“癲癇”為羊癲瘋，羊角風，最早可追溯到《黃帝內經》，該書提出了“胎兒病”和“癲癇”的名稱，其中《素問?奇病論篇》載：“人生而有病癲疾者……病名為胎病此得之在母胎中時，其母有所大驚，氣上而不下，精氣并居，故令子發病發為癲疾也”，可知癲癇的發生與先天因素有關；《丹溪心法》載“無非痰涎壅塞，迷悶孔竅”，可知癇證與痰密切相關。有文獻認為癲癇因痰作祟，并自擬方加減順氣導痰湯治療癲癇，顯示治療有效［6］。同樣也有文獻認為癲癇發作常見痰火內閉，使用清陽癇速康膠囊有效率達89%［7］。

香附、柴胡配伍來源于柴胡疏肝散，出自《醫學統旨》，具有疏肝理氣和活血止痛功效，主治脅肋疼痛、胸悶善太息、情志抑郁易怒、或噯氣、脘腹脹滿、脈弦。柴胡善疏肝解郁為君，香附理氣疏肝而止痛，兩者配伍可解肝經之郁滯，共奏疏肝行氣、活血止痛之功，符合癇證病機，臨床治療癇證療效明確，但具體機制仍需更多研究挖掘。文獻報道柴胡加龍骨牡蠣湯加減可減少顳葉癲癇發作時間，減少發作次數，改善患者睡眠質量［8］。陳士鐸《本草新編》中提及：香附，味苦而甘，氣寒而濃，陽中陰也，無毒；入肝、膽之經；專解氣郁氣疼，調經逐瘀，皮膚瘙癢，止霍亂吐逆，崩漏下血，乳腫癰瘡；宿食能消，泄瀉能固，長頭發，引血至氣分，乃氣血必用之品；香附源于莎草科植物莎草的根莖，味辛、微苦、甘，性平，能疏肝理氣、調經止痛［9］。

本研究共篩選出283 個候選化合物，其中柴胡179 個化學成分，香附104 個，成分-靶點PPI 網絡有204 個節點，1184 條連接，靶基因30 個，同時通過GO 富集分析和基因KEGG 通路，篩選出GABRA1、GRIA2、TRPV1、GSK3B 4 個與癲癇相關的核心基因，篩選出5 條與癲癇相關的通路，分別為：神經活性配體-受體相互作用、雌激素信號通路、膽堿能突觸、乳腺癌、前列腺癌。

北京大學第一醫院學者通過11 例癲癇患者基因測序發現，在GABRA1 基因變異相關的癲癇中，全新致病變異較遺傳變異更常見，由GABRA1基因變異引起的癲癇大多發生在嬰兒期，且多數患者多次癲癇發作預后較好，但仍可能存在不同程度的發育遲緩［10］。有研究團隊通過家系全基因組檢測發現，癲癇患者中GRIA2 基因c.2375G＞T（p.Gly792Val）新生錯義變異，與神經發育障礙伴語言障礙及行為異常相關［11］。研究者回顧了有關靶向TRPV1 的新型分子專利文獻，發現抑制海馬中的TRPV1 可能是預防癲癇發作的新靶標，最重要的是它可以作為癲癇治療未來臨床評估的候選藥物［12］。研究者使用小鼠毛果蕓香堿癲癇模型發現，癲癇小鼠海馬結構中的糖原合酶激酶3β（Gsk3b）mRNA水平降低［13］。

學者研究發現去除卵巢的雌性大鼠的雌二醇對誘導的癲癇狀態大鼠海馬神經具有保護作用［14］。研究結果表明，抗癲癇藥物可以調節海馬體中雄激素和雌激素通路，從而導致顳葉癲癇患者精神和生殖障礙［15］。通過動物實驗，研究學者發現G 蛋白偶聯雌激素受體1 通過改變大腦氧化或者抗氧化參數來介導雌激素信號通路，從而導致戊四氮誘導的大鼠癲癇發作和腦組織氧化損傷［16］。在癲癇活躍的人類大腦皮層中，乙酰膽堿分解代謝酶乙酰膽堿酯酶的活性升高，也發現乙酰膽堿合成酶膽堿乙酰轉移酶的活性在癲癇患者的皮質中被檢測到。另外也有毒蕈堿激動劑毛果蕓香堿和檳榔堿能降低電擊誘發癲癇發作的閾值，并且乙酰膽堿酯酶抑制劑能增加嚙齒動物對化學性驚厥的易感性［17］。乳腺癌耐藥蛋白是一種依賴三磷酸腺苷的外排轉運蛋白，與癲癇和癌癥的多藥耐藥現象有關，是藥物相互作用的潛在來源［18］。

本文通過網絡藥理學方法對柴胡配伍香附治療癲癇作用機制進行初步探討，推測其可能的作用通路，闡述柴胡配伍香附產生抗癲癇作用的機理。本研究發現柴胡配伍香附治療癲癇主要機制與雌激素信號通路、膽堿能突觸、乳腺癌3 個通路相關，但該結果尚需要后續研究進行驗證。